《Journal of Biological Chemistry》：HuR-HuB Autoregulatory Network Governs Inflammatory Factors Expression
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短寿命mRNA在其3'非翻译区（3'UTR）携带AU富集元件（AREs），该元件受到ARE结合蛋白（ARE-binding proteins, ARBPs）的严格调控。尽管Hu家族蛋白能够稳定靶标mRNA，但目前研究主要集中于HuR，因其具有广泛表达特性。Hu
短寿命mRNA在其3'非翻译区（3'UTR）携带AU富集元件（AREs），该元件受到ARE结合蛋白（ARE-binding proteins, ARBPs）的严格调控。尽管Hu家族蛋白能够稳定靶标mRNA，但目前研究主要集中于HuR，因其具有广泛表达特性。Hu家族其他成员长期被认为是神经元特异性蛋白，其在非神经元细胞中的功能尚不完全清楚。值得注意的是，HuB在多种肿瘤及细胞应激条件下显著上调，但其上调的分子机制及功能意义尚不明确。本研究表明，炎症刺激诱导HuR发生胞质转位，HuR直接与HuB mRNA的3'UTR结合，从而增强HuB mRNA的稳定性。上调的HuB通过其RNA识别基序3（RRM3）结构域与HuR的核质穿梭序列（HNS）结合，将HuR滞留于细胞质中。HuB与HuR形成异源复合物，协同调控炎症因子mRNA的稳定性。该研究鉴定HuB为炎症基因的关键转录后调控因子，并突显HuB-HuR调控网络在调节炎症相关mRNA稳定性中的关键作用。
**研究背景与问题提出**
信使RNA（mRNA）编码信号转导、炎症、抗凋亡及肿瘤发生的关键调控因子，这类转录本具有内在不稳定性。为维持其低水平基础丰度，这些转录本受到转录后调控回路的调控，该回路汇聚于其3'非翻译区（3'UTR）的AU富集元件（AREs）。AREs作为二元开关发挥作用，为多种ARE结合蛋白（ARBPs）提供高亲和力结合平台。大多数ARBPs（包括AUF1和TTP）触发mRNA的快速脱腺苷酸化；相反，胚胎致死异常视觉样（ELAVL/Hu）蛋白则稳定含有ARE的mRNA。在外部刺激响应中，Hu家族成员通过改变亚细胞定位或调整蛋白表达水平，增强其与ARBPs竞争结合ARE-containing mRNA的能力，从而稳定靶标mRNA并促进其翻译，最终在炎症、自身免疫病和肿瘤等病理背景下对靶基因表达产生关键调控作用。
Hu家族包含四个成员：HuR、HuB、HuC和HuD。HuR因广泛表达而研究最为深入，多种应激刺激促进其从核内向胞质转位以稳定靶标mRNA。尽管HuB是Hu家族首个被克隆的成员，但长期被认为具有神经元特异性，这一观点限制了其在其他细胞和组织中功能分析的开展。近期转录组学研究通过检测HuB在多种肿瘤类型中的表达，扩展了对HuB功能的认识。Castello等人利用UV交联和PAR-CLIP技术在HeLa细胞中绘制了广泛的HuB-RNA相互作用图谱，提示HuB参与肿瘤中mRNA稳定性的调控。研究人员此前证实炎症刺激上调HuB，后者招募解旋酶DHX9加速细胞因子mRNA的翻译起始。然而，HuB在炎症刺激下维持高表达的机制及其对下游炎症反应的调控方式仍有待阐明。
**研究设计与核心发现**
本研究旨在揭示炎症刺激下HuB上调的分子机制，并探索HuB-HuR复合物在炎症基因表达调控中的关键作用。研究结果表明，应激刺激下HuR向胞质穿梭，结合并稳定HuB mRNA，从而驱动HuB过表达。HuB不仅通过直接相互作用促进HuR的胞质积累，还与HuR形成异源二聚体以增强对靶标mRNA稳定性的调控。这些发现揭示HuB不仅是受调控分子，也是与HuR相互作用并协同稳定炎症因子mRNA的主动调控因子。
**关键技术与方法**
本研究主要采用以下关键技术：细胞系模型（HEK293细胞系、MLE12小鼠肺泡上皮细胞系）与动物模型（C57BL/6小鼠LPS诱导的肺部炎症模型）；RNA免疫沉淀（RNA-IP）与甲醛交联RNA免疫沉淀（cross-linked RIP）技术用于检测蛋白-RNA相互作用；RNA电泳迁移率变动分析（RNA-EMSA）用于验证蛋白与ARE序列的直接结合；放线菌素D追踪实验用于测定mRNA半衰期；免疫共沉淀（Co-IP）与邻近连接分析（PLA）用于验证蛋白-蛋白相互作用；GST pull-down与His标签蛋白纯化用于体外验证结构域相互作用；免疫组织化学分析用于人肺组织芯片（40对肺腺癌及癌旁组织，以及正常肺、肺炎、炎性假瘤和肺结核组织）。
**研究结果**
**一、HuR在炎症刺激下以转录后水平上调HuB表达**
肿瘤坏死因子α（TNFα）刺激显著上调HEK293细胞中HuB的mRNA和蛋白水平，且HuR胞质转位的时间窗口与HuB mRNA上调高度一致。HuR敲低显著降低TNFα刺激后HuB的蛋白和mRNA水平，而外源表达GFP-HuR可挽救这一效应。放线菌素D（Act D）追踪实验显示，TNFα持续处理显著降低HuB mRNA降解速率，而HuR敲低进一步缩短HuB mRNA半衰期，直接证实HuR稳定HuB mRNA。通过分析已发表HuR PAR-CLIP数据及进行交联RIP实验，研究证实HuR结合于HuB 3'UTR。RNA-EMSA实验进一步验证HuR和HuB均可直接结合HuB 3'UTR中的ARE序列，且未标记ARE RNA可竞争性抑制该结合，突变ARE序列则消除结合。这些发现揭示了一个协同的HuB-HuR自调节网络在炎症反应中调控HuB mRNA稳定性。
**二、炎症刺激诱导HuB结合炎症因子mRNA的ARE序列**
鉴于HuB在TNFα处理细胞中上调，研究人员进一步探究其是否调控炎症因子表达。HuB敲低显著降低多种炎症因子的mRNA和蛋白表达水平。胞质RNA-IP实验证实HuB结合这些炎症因子mRNA。体外RNA-EMSA使用纯化重组His-GFP-HuB蛋白，证明HuB直接结合TNFα、CXCL1和CXCL2 3'UTR中的ARE区域，未标记ARE RNA可竞争性抑制该结合，突变TNFα ARE则消除HuR和HuB的结合。此外，HuR和HuB结合相同的ARE串联重复探针，形成分子量相近的复合物。这些发现确立HuB作为胞质ARE-mRNA稳定化网络的关键组分，在炎症刺激下调控转录后基因表达中发挥关键作用。
**三、HuB通过阻止HuR核返而将HuR滞留于细胞质**
研究人员发现，HuB敲低后回补HuR无法挽救炎症因子mRNA表达的降低，而HuB回补可恢复这些炎症因子的表达，支持高表达HuB在应激条件下的功能必要性。在HuR敲低细胞中，即使用HuB过表达，炎症因子表达仍受抑制；单独敲低HuR或HuB均显著缩短炎症因子mRNA半衰期。这些结果证明HuR和HuB在胞质中发挥非冗余的协同作用。进一步实验显示，HuB敲低导致HuR与靶mRNA的结合复合物显著减少，Flag-HuB外源表达导致HuR胞质组分显著增加，该效应在TNFα处理下进一步放大；GFP-HuB与Flag-HuR共转染可诱导Flag-HuR向胞质重新分布，而GFP-HuR与Flag-HuR共转染无此效应。siRNA介导的HuB敲低完全消除TNFα诱导的HuR核输出，而HuR敲低不影响HuB的胞质定位。这些结果证实HuB促进HuR的胞质积累。
**四、HuB通过其RRM3结构域与HuR的HNS结构域直接相互作用**
研究人员通过双向Co-IP实验证实HuB与HuR在基础条件下存在物理相互作用，TNFα刺激后显著增强。RNase处理实验显示该相互作用不依赖RNA，但RNA可增强其结合。邻近连接分析（PLA）提供细胞原位直接视觉证据，TNFα处理后HuB-HuR近端相互作用信号显著增加。体外pull-down实验使用纯化重组蛋白证实HuB与HuR的直接物理相互作用，且异源相互作用强于各自的同源二聚化相互作用。通过构建系列截短GST标签表达质粒进行结构域映射，研究鉴定HuB-HuR相互作用由HuB的RRM3结构域和HuR的HNS结构域介导。与核输入蛋白TRN1和TRN2相比，HuB对HuR具有更强的结合能力。细胞实验中，删除HuR HNS结构域或HuB RRM3结构域均显著削弱其物理相互作用。在HuB敲低细胞中，野生型HuB可恢复HuR与核输出蛋白的相互作用及HuR胞质积累，而RRM3缺失突变体则不能；RRM3结构域缺失虽不影响HuR结合mRNA，但显著降低炎症因子mRNA半衰期。这些结果表明HuB通过其RRM3结构域与HuR HNS结构域相互作用，对HuR的胞质滞留和炎症因子mRNA稳定性至关重要。
**五、HuB-HuR复合物对炎症因子表达及炎症过程至关重要**
基于在线数据库预测，HuR蛋白水平在14种癌症类型中无显著变化，而HuB在肿瘤组织中较正常对照组织上调。免疫组织化学分析显示，炎症或肿瘤条件上调HuB表达并主要促进HuR胞质积累，正常肺组织中HuB表达相对较低而炎症/肿瘤条件下显著增强。研究人员建立LPS诱导的小鼠肺部炎症模型：LPS显著上调小鼠肺组织中HuB mRNA和蛋白表达，增强HuR胞质积累，促进HuB与炎症因子mRNA的结合及HuB-HuR相互作用。在小鼠肺泡上皮细胞系MLE-12中，Co-IP和PLA一致证实HuB与HuR的物理相互作用，LPS刺激进一步增强该相互作用。HuB敲低不仅抑制Cxcl1、Cxcl2和Tnfα的表达，还抑制炎症刺激下HuR的胞质积累。这些结果进一步确立HuB在促进HuR胞质积累和炎症因子表达中的关键调控作用，同时突显HuB作为炎症性疾病或肿瘤生物标志物的潜力。
**讨论与结论**
短寿命ARE-containing mRNA对细胞应激反应、存活和免疫至关重要，其半衰期直接决定编码蛋白的丰度，从而塑造代谢、细胞死亡、免疫激活和肿瘤发生等过程。Hu家族蛋白严格调控这些mRNA的稳定性，但其核质定位和表达机制尚不清楚。本研究阐明了应激诱导HuB上调和HuR胞质积累的调控机制，鉴定了HuR与HuB之间的协同自调节网络：应激刺激触发HuR核输出，使其结合并稳定HuB mRNA；上调的HuB进一步与HuR形成复合物，促进HuR胞质滞留并协同调控炎症因子表达。
基因表达调控是多步骤、多层次的复杂过程。当细胞响应外部刺激时，除靶基因mRNA合成的转录调控外，mRNA稳定性的转录后控制代表真核细胞进化出的更敏感、便捷和高效的调控机制。越来越多的证据表明，RNA结合蛋白（RBPs）常通过自调节反馈机制调控自身表达，如通过结合自身转录本调节mRNA稳定性和/或翻译效率。本研究中，炎症刺激上调HuB mRNA和蛋白表达，其机制在于炎症信号促进HuR胞质转位，进而稳定HuB mRNA，积累的HuB蛋白进一步通过结合自身转录本并与HuR协同增强该稳定化作用，形成正反馈环路。这些发现拓宽了Hu家族自调节作为独立机制的传统认识，揭示了一种此前未被认识的相互依赖调控网络。
研究人员提出以下模型：正常细胞条件下，细胞内降解性ARE结合蛋白如ZFP36L2结合HuB mRNA以维持其低水平表达；一旦细胞暴露于炎症刺激等外部刺激，HuR从核内转移至胞质，与其他ARE结合蛋白或microRNAs竞争结合位点，稳定HuB mRNA并促进HuB蛋白表达。这一协同自调节机制确保HuB的快速持续上调，作为细胞启动有效炎症反应的关键适应机制。然而，HuR如何与其他ARE结合蛋白或microRNAs竞争结合HuB mRNA及其分子机制仍有待未来研究探索。此外，尽管多项研究表明Hu家族成员表达主要在转录后水平受调控，但HuR已被证明是胃癌细胞中NF-κB的直接转录靶标，其激活依赖于磷脂酰肌醇3-激酶/AKT（PI3K/AKT）信号通路；NF-κB信号通路能否在炎症刺激下直接影响HuB mRNA水平或通过调控其他蛋白间间接调节HuB表达，亦需未来研究阐明。
HuR主要定位于细胞核，调控mRNA成熟并形成复合物协同转运至胞质，在胞质中通过抑制其他RBPs或microRNAs的结合稳定靶标mRNA。本研究表明，炎症刺激下高表达的HuB与HuR结合相同的ARE-containing mRNA，但并非HuR的补偿性蛋白。单独沉默HuR或HuB均显著降低炎症因子表达，表明HuR-HuR复合物对炎症因子表达不可或缺，突显其在Hu家族介导的炎症转录后调控中的非冗余协同作用。
尽管HuR和HuB全长蛋白的晶体结构尚未完全解析，且计算预测的相互作用氨基酸残基置信度较低，但本研究通过实验数据明确证实HuB通过其RRM3结构域与HuR的HNS结构域直接结合。由于HuR的HNS结构域通过其嵌入的核定位信号（NLS）和核输出信号（NES）调控核质穿梭，研究人员提出：胞质高表达的HuB结合HuR的HNS结构域以遮蔽HuR的NLS，阻断HuR与TRN1、TRN2及importin α/β的相互作用，从而将HuR滞留于胞质。尽管额外辅助因子或炎症特异性修饰的潜在贡献尚待阐明，本研究将HuB鉴定为炎症诱导的"守门蛋白"，调控HuR的胞质滞留并影响转录后炎症反应程序的幅度。
尽管HuR已被提议作为治疗靶点，但其总表达水平在炎症刺激或多种肿瘤中无显著变化，而是在胞质中积累。本研究表明，HuB在肺炎、炎性假瘤和肺结核组织中以及LPS诱导的小鼠肺部炎症模型中显著上调，且与HuR胞质积累呈正相关。HuB敲低显著抑制HuR胞质定位和炎症因子表达。这些发现提示HuB作为炎症和癌症诊断生物标志物的潜力，并突显通过靶向HuB表达或HuB-HuR相互作用治疗炎症性疾病或肿瘤的可行性。
**研究结论**
综上所述，研究人员阐明了炎症刺激诱导HuB上调的分子基础及功能影响。研究证实，炎症信号触发HuR核输出，后者通过稳定HuB mRNA在转录后水平促进HuB表达；新诱导的HuB反过来将HuR滞留于细胞质，组装mRNA稳定化复合物，阻止HuR核返，从而放大关键炎症介质的表达。这些发现揭示了Hu家族蛋白之间自我强化的调控环路，该环路调节炎症反应，并突显这一轴作为炎症驱动病理（包括肿瘤）候选治疗靶点的重要性。本论文发表在《Journal of Biological Chemistry》。
