已获批用于CDKL5缺陷障碍的治疗药物Ganaxolone是一种蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）抑制剂

《Journal of Biological Chemistry》：Ganaxolone, an approved therapy for CDKL5-Deficiency Disorder, is an inhibitor of PTP1B

　　

CDKL5缺陷障碍（CDD）由CDKL5基因的新生（de novo）突变引起，可导致智力障碍、言语和运动缺陷，以及最早可在出生后六周出现的癫痫发作。2022年初，美国食品药品监督管理局（FDA）批准ganaxolone（商品名：Ztalmy）用于治疗2岁及以上CDD患者的癫痫发作。已有报道指出，ganaxolone作为γ-氨基丁酸A型受体（GABA_A receptor）激动剂，可帮助降低神经元兴奋性；然而，基于其化学结构，研究人员提出假设，ganaxolone还可能作为蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）抑制剂发挥作用。研究观察到，ganaxolone无论在体外酶活性测定还是在不同细胞模型中，均能够抑制PTP1B活性，其效力与已知PTP1B抑制剂相近，包括具有相似化学结构的MSI-1436。此外，在分化中的SH-SY5Y细胞中，抑制PTP1B可增强酪氨酸激酶受体B（TRKB）/脑源性神经营养因子（BDNF）信号传导。这一效应在PTP1B表达升高的CDKL5敲除（CDKL5-KO）细胞中尤为显著。在这些细胞中，抑制PTP1B不仅可将BDNF信号恢复至接近野生型细胞的水平，还可恢复细胞形态。研究结果提示，与Rett综合征类似，靶向PTP1B可能成为CDD的一种有益治疗策略。

本文发表于《Journal of Biological Chemistry》，围绕CDKL5缺陷障碍（CDD）的潜在治疗机制展开，核心问题是当前已获批药物ganaxolone是否除作为γ-氨基丁酸A型受体（GABA_A受体）正向变构调节剂外，还存在可解释其疗效的另一分子作用靶点。CDD属于Rett样综合征，主要由CDKL5基因功能缺失突变引起，临床表现包括早发癫痫、严重发育迟缓、运动和言语障碍等。尽管基因治疗具有理论上的根治前景，但神经系统递送效率、表达剂量控制及安全性仍构成现实障碍，因此开发基于病理信号通路的药物干预策略具有重要意义。既往研究已显示，在Rett综合征模型中，蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）表达升高，并通过抑制脑源性神经营养因子（BDNF）/酪氨酸激酶受体B（TRKB）等关键信号通路参与疾病表型形成。基于ganaxolone与多种甾体样PTP1B别构抑制剂在结构上的相似性，研究人员检验了其是否同样具有PTP1B抑制活性，并进一步评估这一作用是否可改善CDD相关细胞缺陷。

方法概括：研究人员首先采用纯化PTP1B蛋白及DiFMUP底物进行体外磷酸酶活性测定，以评估ganaxolone对PTP1B的抑制能力；随后在293T细胞、293T-PTP1B-KO细胞及SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中，通过受体酪氨酸磷酸化与下游信号检测验证细胞内效应。研究进一步利用视黄酸（RA）诱导SH-SY5Y分化，结合CRISPR-Cas9构建CDKL5-KO、PTP1B-KO及双敲除细胞模型，并通过免疫印迹和免疫荧光分析TRKB/BDNF信号、神经突长度及串珠样膨大（varicosities）变化。

研究首先证实了ganaxolone对PTP1B的直接抑制作用。

Ganaxolone is an inhibitor of PTP1B in vitro
研究人员基于化学结构比较指出，ganaxolone具有与MSI-1436、DPM-1001等已知PTP1B别构抑制剂相似的甾体核心结构。利用DiFMUP作为底物进行体外磷酸酶实验发现，ganaxolone能够有效抑制PTP1B活性，其半数抑制浓度IC₅₀为600 nM ± 28 nM，与MSI-1436的480 nM ± 20 nM相近。这一结果直接说明，ganaxolone不仅是神经类固醇药物，还具有明确的PTP1B抑制活性。

随后，研究在细胞水平验证了这一作用是否成立。

Ganaxolone inhibits PTP1B in cell models
在野生型293T细胞中，经ganaxolone预处理后再给予表皮生长因子（EGF）刺激，可观察到表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸磷酸化增强，且幅度与MSI-1436处理相似。相比之下，在293T-PTP1B-KO细胞中，各处理条件下EGFR磷酸化水平接近，提示ganaxolone在该体系中的效应依赖PTP1B存在。研究人员又在未分化SH-SY5Y细胞中重复实验，发现ganaxolone可增强胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）磷酸化，并促进下游蛋白激酶B（AKT）活化。结构不同的PTP1B抑制剂CPT-157633也产生类似效应，从而进一步支持ganaxolone在神经元样细胞模型中通过抑制PTP1B发挥作用。

接着，研究转向CDD更相关的神经分化背景，考察PTP1B抑制对BDNF/TRKB通路的影响。

PTP1B inhibition increases TRKB expression and signaling during differentiation
SH-SY5Y细胞在视黄酸诱导下可分化为具有神经元样突起的成熟样细胞。研究人员在分化6天后给予ganaxolone或MSI-1436预处理，再以BDNF刺激细胞，结果发现药物处理组TRKB磷酸化在5分钟时明显高于对照组。由于TRKB是BDNF信号转导的关键受体，而PTP1B已知可使其去磷酸化失活，因此该结果表明，抑制PTP1B能够增强分化神经元样细胞中的TRKB/BDNF信号。这也说明ganaxolone的作用并不限于抑制神经元兴奋性，而可能同时改善影响神经发育与突触维持的营养信号网络。

在此基础上，研究进一步检验CDKL5缺失是否伴随PTP1B异常升高。

Ablation of CDKL5 leads to elevated expression of PTP1B
研究人员通过CRISPR-Cas9构建CDKL5敲除SH-SY5Y细胞（C5KO）以模拟CDD中的功能缺失状态。该模型中，EB2 Ser²²²位点磷酸化下降，证明CDKL5激酶功能缺失得到体现。更重要的是，CDKL5敲除导致PTP1B蛋白水平显著升高。这一点与既往Rett综合征中MECP2缺失伴随PTP1B上调的现象相呼应，说明在不同Rett样综合征中，PTP1B升高可能是共同的病理节点。进一步实验显示，C5KO细胞分化后接受BDNF刺激时，其TRKB磷酸化弱于野生型；但经ganaxolone或MSI-1436处理后，TRKB磷酸化水平可恢复至接近野生型水平。由此可见，CDKL5缺失引起的BDNF信号损害至少部分可通过抑制PTP1B得到逆转。

除信号异常外，CDD的重要病理基础还包括神经元形态发育缺陷，研究对此也进行了系统分析。

Loss of PTP1B rescues morphological defects associated with CDKL5 knockout in differentiated SH-SY5Y cells
在分化SH-SY5Y模型中，CDKL5缺失导致神经突样延伸长度缩短，提示神经元样形态成熟受损；相反，PTP1B敲除会增加神经突长度。更关键的是，在CDKL5/PTP1B双敲除细胞中，CDKL5缺失所致的长度缩短得到明显挽救。研究同时分析了神经突上的串珠样膨大结构（varicosities）。结果显示，CDKL5缺失使该结构数量减少，而抑制PTP1B则显著增加其数量；双敲除同样恢复了CDKL5缺失导致的下降。最后，在CDKL5-KO细胞分化过程中持续加入ganaxolone或MSI-1436，也可显著提高神经突长度。上述结果表明，无论通过遗传方式去除PTP1B，还是通过药理学方式抑制PTP1B，均可改善CDKL5缺失背景下的形态异常。这不仅强化了PTP1B在CDD细胞病理中的功能地位，也提示ganaxolone可能通过这一靶点促进神经元结构恢复。

讨论部分进一步将这些发现置于CDD治疗策略的整体框架中加以阐释。研究指出，CDD目前的治疗主要针对癫痫症状，而ganaxolone虽已获批，但其对非癫痫症状的改善有限，且临床用量较高，因此重新审视其作用机制具有现实意义。本文数据表明，ganaxolone是PTP1B抑制剂，这可能构成其重要的“脱靶”但潜在有益效应。由于PTP1B不仅调节BDNF/TRKB信号，还参与胰岛素/IGF-1通路、代谢稳态及神经炎症调控，因此靶向PTP1B有望比单纯调节GABA_A受体产生更广泛的疾病修饰效应。研究还强调，CDKL5缺失导致PTP1B升高，意味着疾病细胞可能对PTP1B抑制更为敏感，从而为治疗窗口提供依据。

研究结论部分可概括为：ganaxolone在体外和细胞模型中均可抑制PTP1B活性，其效力与已知PTP1B别构抑制剂相当；在CDKL5缺失的神经元样细胞中，PTP1B表达升高，抑制PTP1B能够恢复受损的BDNF/TRKB信号并改善细胞形态异常。研究结果支持将PTP1B视为CDD潜在的可成药治疗靶点，并提示ganaxolone在CDD中的治疗作用可能部分源于其对PTP1B的抑制。