《Journal of Biological Chemistry》：LATS kinase activity and tumor suppressor function are regulated by a second autophosphorylation site
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Hippo信号通路调控细胞增殖、分化和存活。LATS激酶（LATS1和LATS2）是该通路中的核心激酶，由MST/MAP4K通过疏水模体（Hydrophobic Motif, HM）位点的磷酸化而激活，这引导了后续活化环（Activation Loop, AL
Hippo信号通路调控细胞增殖、分化和存活。LATS激酶（LATS1和LATS2）是该通路中的核心激酶，由MST/MAP4K通过疏水模体（Hydrophobic Motif, HM）位点的磷酸化而激活，这引导了后续活化环（Activation Loop, AL）的自磷酸化。在此，研究人员鉴定出激酶结构域内一个保守的自磷酸化位点（LATS1中的Ser872和LATS2中的Ser835），其位于经典的HXRXXS模体中，被命名为经典LATS1/2底物（Canonical LATS1/2 Substrate, CLS）位点。CLS位点的磷酸化是LATS激酶完全激活所必需的，将该丝氨酸替换为丙氨酸会显著损害YAP的磷酸化，从而增强LATS激酶关键下游效应因子YAP的致癌活性。这些结果为了解LATS激酶活性的调控机制及Hippo通路的生物学功能提供了新的见解。
研究背景：Hippo信号通路是多细胞生物中高度保守的生长控制机制，通过调节细胞增殖、分化、存活、器官大小稳态及肿瘤发生发挥关键作用。该通路核心为激酶级联反应，其中Ste20样激酶（MST1/2）及丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶（MAP4K1-7）磷酸化并激活大肿瘤抑制激酶（LATS1/2），活化的LATS1/2进而磷酸化转录共激活因子YAP（Yes-associated protein）和TAZ（Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，也称WWTR1），阻止其入核及TEAD介导的转录激活。LATS激酶属于AGC激酶家族，其经典激活机制为两步磷酸化：上游激酶首先磷酸化C端疏水模体（HM，LATS1 Thr1079，LATS2 Thr1041），启动LATS激酶随后在活化环（AL，LATS1 Ser909，LATS2 Ser872）的自磷酸化，这对催化激活至关重要，MOB1A/B的结合促进磷酸化事件并稳定活性构象。尽管有这些认识，LATS激酶激活的调控全貌仍不完全清楚，特别是LATS激酶是否含有微调其催化潜力的额外自磷酸化位点尚未知。因此，研究人员开展了本研究，旨在鉴定并表征LATS激酶中可能存在的新型自磷酸化位点及其功能影响。
本研究发表在《Journal of Biological Chemistry》。研究人员通过生化、细胞生物学及体内实验，鉴定出LATS激酶激酶结构域内一个保守的新型自磷酸化位点CLS（LATS1 Ser872，LATS2 Ser835），证明其受上游信号调控，可发生分子内或分子间自磷酸化，并且CLS与AL位点的磷酸化相互协同。CLS位点的磷酸化是LATS激酶完全激活所必需的，其磷酸化缺陷会削弱LATS激酶活性，减少YAP磷酸化及胞质滞留，上调YAP/TAZ靶基因表达，最终损害LATS2的肿瘤抑制功能，促进细胞增殖与克隆形成，抑制凋亡，并在裸鼠异种移植模型中加速肿瘤生长。该研究的意义在于揭示了LATS激酶活性调控的新层面，为理解Hippo通路输出及生理功能的精细调控提供了新机制，也为针对LATS激酶设计分子探针或治疗药物时考虑CLS磷酸化状态提供了依据。
主要关键技术方法：研究使用HEK293A、HEK293T、MCF10A、HEPG2、DLD1等细胞系，包括野生型、特定激酶敲除（如LATS1/2双敲除dKO、MST1/2;MAP4K1-7九重敲除9KO）及基因编辑（CRISPR/Cas9介导的LATS2 CLS-A敲入）细胞系。关键方法包括：免疫沉淀（IP）与免疫印迹（IB）分析内源或外源蛋白的磷酸化状态；定制磷酸化特异性抗体（抗pCLS）并进行点印迹及肽竞争实验验证；质谱分析磷酸化肽段；体外激酶实验以检测LATS激酶活性及自磷酸化；qPCR及RNA测序（RNA-seq）分析YAP/TAZ靶基因及全局转录谱；免疫荧光观察YAP亚细胞定位；细胞克隆形成、增殖及Annexin V/PI凋亡检测；裸鼠皮下异种移植瘤模型评估体内肿瘤生长，并行H&E及免疫组化（IHC）分析增殖与凋亡标志物。
研究结果：
Identification and regulation of the canonical LATS1/2 substrate site (CLS)：研究人员注意到LATS激酶底物通常含有HXRXXS/T共识模体，并在LATS1/2激酶结构域中鉴定出保守的丝氨酸残基（LATS1 Ser872，LATS2 Ser835），位于HXRXXS模体内，不同于已知的AL及HM位点，命名为CLS位点。质谱分析纯化的人LATS2野生型蛋白证实CLS位点发生磷酸化，且该位点及AL、HM位点在物种间高度保守。AlphaFold预测结构显示CLS与AL位于催化中心附近的同一环区。研究人员制备了特异性抗pCLS抗体，经λ磷酸酶处理、点印迹及肽竞争实验验证其特异性。随后研究人员发现，血清饥饿、细胞骨架破坏（LatB处理）、高细胞密度及STRIPAK复合体成分STRIP1/2敲低等多种激活Hippo通路的刺激，均能上调内源性LATS1 CLS位点的磷酸化，同时伴随AL、HM磷酸化增加及YAP Ser127磷酸化升高，表明CLS磷酸化受上游Hippo通路信号调控且与LATS激酶激活相关。
CLS functions as an autophosphorylation site of the LATS kinases：研究人员进一步探究CLS位点磷酸化的来源。在MST1/2;MAP4K1-7（9KO）细胞中LATS1 CLS磷酸化显著降低，而过表达上游激酶MST1、MST2、MAP4K4则增强LATS2 CLS磷酸化，变化模式与AL及HM一致。使用模拟磷酸化的HM-D/E突变体（Thr1041D/E）可显著提高CLS磷酸化，而激酶失活突变体KR（Lys697Arg）则检测不到CLS磷酸化。体外激酶实验添加ATP后，纯化的LATS2在CLS及AL位点磷酸化均逐渐增加，证明CLS为自磷酸化位点。进一步位点特异性突变分析显示，CLS-A与AL-A突变相互降低对方的磷酸化，但HM磷酸化影响不大；在HM-D背景下，CLS-A或AL-A单一突变仍能分别恢复部分AL或CLS磷酸化，表明HM磷酸化促进CLS与AL自磷酸化，而CLS与AL磷酸化可相互独立发生并相互加强。共表达激酶死突变体（KR）与野生型或HM-D突变体时，KR突变体的CLS位点可发生反式自磷酸化，提示存在分子间自磷酸化。
CLS phosphorylation is required for full activation of LATS2：研究人员评估CLS磷酸化对LATS激酶功能的影响。体外激酶实验显示，LATS1/2的CLS-A或CLS-D（Ser→Asp）突变均显著削弱其激酶活性，但弱于AL-A或AL-D突变的影响；在HM-D/E活性背景中引入CLS-A突变也显著减弱激酶活性，AL-A与CLS-A双突变在HM-D/E背景下造成更显著的活性降低。LATS2及其CLS突变体与YAP相互作用亲和力和野生型相似，但CLS-A/D突变体对YAP磷酸化及YAP Ser127磷酸化依赖的带移能力较弱，对YAP靶基因CTGF和CYR61表达的抑制能力也弱于野生型LATS2，且在LATS1/2 dKO的HEK293A及MCF10A细胞中均观察到类似结果；在LATS1 KO及LATS2 CLS-A敲入的DLD1细胞中也显示CLS-A削弱LATS2介导的YAP抑制。因此CLS磷酸化是LATS2完全激活及后续YAP/TAZ转录失活所需。
CLS phosphorylation regulates YAP activity in cancer cells：研究人员在肝癌细胞系HEPG2的LATS1/2 dKO背景下稳定回补野生型或CLS-A突变LATS2。CLS-A突变体对YAP磷酸化的抑制减弱，YAP靶基因表达升高，且无法像野生型LATS2那样有效促进YAP胞质滞留。RNA-seq与PCA分析显示野生型LATS2引起全局转录谱的显著改变，而CLS-A突变体的影响明显较弱；GSEA分析表明CLS-A突变减弱了Hippo通路相关基因集的抑制，对经典YAP靶基因的表达抑制也更弱，并影响核糖体功能及代谢相关基因表达。比较CLS-A、AL-A及KR突变体，CLS-A对LATS2激酶活性及YAP抑制的削弱程度介于AL-A与KR之间。
Loss of CLS phosphorylation impairs the tumor-suppressive function of LATS2：研究人员进一步在HEPG2细胞中评估CLS磷酸化对肿瘤相关表型的影响。CLS-A突变体相较于野生型LATS2，增强了细胞克隆形成能力，加快细胞增殖，并减少早期及晚期凋亡细胞比例。裸鼠皮下异种移植实验中，表达CLS-A的细胞成瘤更快，肿瘤体积与重量更大；IHC分析显示CLS-A肿瘤中YAP/TAZ及增殖标志物磷酸组蛋白H3（PH3）表达更高，凋亡标志物Cleaved Caspase-3表达更低。因此LATS2 CLS位点磷酸化缺失损害其肿瘤抑制功能，促进HEPG2细胞体内外肿瘤发生。
讨论：本研究鉴定出CLS作为LATS激酶激酶结构域内新的自磷酸化位点。生化与功能研究凸显CLS磷酸化在激活LATS2激酶及抑制YAP/TAZ转录活性中的关键作用，阻止该位点磷酸化会削弱LATS激酶抑制细胞生长的能力，并可能促进肿瘤进展。LATS激酶整合多样上游信号调控YAP/TAZ活性，因此其活性必须被严格调控；除已知的HM priming磷酸化及AL自磷酸化外，研究人员证明CLS位点磷酸化也是LATS激酶完全激活所需。CLS与AL均位于催化中心周围较长的活化环区域，并可发生自磷酸化。虽然这些自磷酸化事件如何促进激酶激活尚不完全清楚，但推测CLS或AL磷酸化可能影响催化中心的开关构象，从而影响酶效率；CLS也可能作为底物进入的屏障，其磷酸化可能将其从催化中心移开，使YAP/TAZ等底物可被磷酸化。与AL位点类似，CLS位点的磷酸化缺陷型（A）及磷酸化模拟型（D）均削弱LATS激酶活性，提示静态突变不能完全重现该位点磷酸化的动态调控效应，也不能完全排除CLS突变通过影响局部结构而抑制激酶活性的可能，未来结构研究有助于阐明。CLS磷酸化受血清饥饿、细胞密度等多种上游信号调控，且可发生分子间自磷酸化，但是否发生分子内自磷酸化尚待确定；此外有报道CHK1可在UV照射时磷酸化LATS2 CLS位点，故CLS磷酸化可能受细胞微环境依赖的多种机制调控。LATS激酶是癌症治疗与再生医学的理想靶点，针对LATS激酶设计分子探针或药物时需考虑CLS磷酸化状态，因其可能影响抑制剂或激活剂与LATS激酶的亲和力。
研究结论：研究人员鉴定出CLS是LATS激酶激酶结构域内新的自磷酸化位点。生化与功能研究强调CLS磷酸化对激活LATS2激酶及抑制YAP/TAZ转录活性的关键作用。阻止该位点磷酸化会削弱LATS激酶抑制细胞生长的能力，并可能促进肿瘤进展。
