《Canadian Journal of Microbiology》：Azospirillum brasilense and tomato exudate or cytidine increase phytopathogen resistance and modulate phyllosphere/rhizosphere
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番茄是全球重要作物，植物病原体可造成毁灭性损失。本研究描述了一种处理方式，由巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）Sp7与番茄幼苗渗出物，或渗出物成分胞苷（CYD）组成。A. brasilense Sp7与胞苷联合处理在经丁香假单胞菌番
番茄是全球重要作物，植物病原体可造成毁灭性损失。本研究描述了一种处理方式，由巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）Sp7与番茄幼苗渗出物，或渗出物成分胞苷（CYD）组成。A. brasilense Sp7与胞苷联合处理在经丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato）DC3000攻击的番茄中表现出显著效果，使病害严重度降低83.4%。以渗出物替代胞苷时效果较弱，为71%，但病害严重度下降幅度仍高于单独使用A. brasilense Sp7的55%。这种病害严重度的降低并未伴随叶匀浆中P. syringae数量的下降。胞苷使根匀浆中A. brasilense Sp7的16S rDNA丰度增加6.7倍。在叶际（phyllosphere）和根际（rhizosphere）中，各处理调节了微生物组成。在叶际中，可计算出处理组与细菌目水平分类单元之间的特异性关联。在根际中，主成分分析（PCA）显示，PC1方向上的变异主要由A. brasilense的存在或缺失所主导。值得注意的是，该接种菌提高了其他固氮螺菌目（Azospirillales）物种的丰度。
该论文发表于《Canadian Journal of Microbiology》，研究聚焦于植物生长促进根际细菌（PGPR，plant growth-promoting rhizobacteria）与植物渗出物协同提升番茄抗病性的可能机制，并进一步考察其对叶际与根际微生物群落结构的影响。番茄（Solanum lycopersicum）是全球范围内具有重要经济价值的蔬菜作物，但真菌性与细菌性植物病原体均可导致显著减产。其中，丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato）是研究番茄细菌性病害的重要模式病原。另一方面，巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）作为典型PGPR，已知可通过促生、改善根系结构、增强养分吸收和重塑植物微生物组等方式促进宿主健康。然而，如何利用植物渗出物中的特定化合物增强该菌定殖能力，并进一步放大其抗病效应，仍缺乏系统证据。已有研究表明，植物渗出物不仅参与根际趋化招募，也可直接影响植物健康与病害防御。胞苷作为研究团队此前在豌豆、番茄和黄瓜幼苗渗出物中鉴定出的核苷类成分之一，被证实可作为A. brasilense的趋化引诱物，并促进幼苗根系结构发育。因此，开展本研究的必要性在于检验：番茄幼苗渗出物或其中代表性成分胞苷，是否能够增强A. brasilense Sp7对番茄抗丁香假单胞菌感染的保护作用，并明确这种处理是否同时重塑植物叶际与根际微生态。
研究人员构建了包含A. brasilense Sp7、病原菌P. syringae pv. tomato DC3000、番茄幼苗渗出物以及胞苷不同组合的12个处理组，对病害严重度、病原菌在叶部的丰度、A. brasilense在根部的丰度，以及叶际和根际16S rDNA微生物组成进行综合分析。研究结论表明，A. brasilense Sp7与胞苷联合处理的抗病效果最强，可使病害严重度降低83.4%；与番茄幼苗渗出物联合处理也有明显效果，降低71%；均优于A. brasilense Sp7单独处理的55%。值得注意的是，病害缓解并不对应于叶部病原菌丰度下降，而胞苷可显著提高根部A. brasilense Sp7的16S rDNA丰度，提示其作用可能与促进有益菌根际富集及诱导宿主防御状态有关，而非直接抑制病原菌定殖。进一步地，处理显著调节了叶际和根际微生物结构，其中根际群落的主要变异受A. brasilense是否存在的影响最为显著。该研究的重要意义在于提出了一种结合PGPR与植物源信号分子的抗病干预策略，为番茄病害绿色防控及微生物组定向调控提供了实验依据。
本研究主要采用以下关键技术方法：以黄梨番茄种子为材料，在无菌基质中培养并设置12个处理组；4周龄植株采用浸蘸法接种P. syringae pv. tomato DC3000，6 d后按叶片死亡百分比评估病害严重度；通过叶片匀浆平板活菌计数、16S rDNA测序及数字PCR（dPCR，digital PCR）检测病原菌丰度；通过根匀浆16S rDNA分析评估A. brasilense Sp7丰度；从同一植株叶和根样本中提取基因组DNA，进行V3/V4区16S rDNA高通量测序，并结合系统发育树、丰富度分析、热图、主成分分析（PCA）和余弦相似度分析比较叶际与根际微生物群落变化。16S样本来源于一次植物病原试验中的3株植物叶与根匀浆。
一、Treatments decreased disease severity on pathogen-challenged tomatoes
研究人员首先评估不同处理对病原菌攻击后番茄病害严重度的影响。结果显示，在未接种病原菌条件下，各组病害严重度仅为1%–2%。而在接种P. syringae pv. tomato DC3000后，未处理对照组平均叶片死亡率达80.3%。单独接种A. brasilense Sp7可将该数值降至36.1%，对应病害严重度降低55%。当A. brasilense Sp7与番茄幼苗渗出物联用时，叶片死亡率降至23.3%，病害降低71%；与胞苷联用时进一步降至13.3%，病害降低83.4%。该结果说明，A. brasilense Sp7具备显著的抗病促进能力，而胞苷较总渗出物更能增强这种保护作用。
二、The treatments did not decrease abundance of the pathogen on leaves, cytidine increased abundance of the PGPR on roots
为解释病害减轻原因，研究人员分别检测叶部病原菌丰度与根部有益菌丰度。叶片中Pseudomonas丰度通过King’s B培养基活菌计数、16S rDNA测序及hrpL基因数字PCR三种方法评估。结果一致表明，在病原菌攻击组内部，不同处理之间病原菌丰度差异均无统计学显著性，即无论A. brasilense Sp7单独作用还是与渗出物、胞苷联合，均未降低叶部P. syringae负荷。这说明病害症状缓解并非来源于病原菌数量下降。另一方面，根部A. brasilense Sp7丰度分析显示，胞苷可使其16S rDNA丰度提高6.7倍，提示胞苷可能通过增强根际定殖促进PGPR发挥作用。平板计数与dPCR未能检测到相应信号，研究人员据此认为A. brasilense在根中的绝对丰度可能较低，而16S rDNA分析对此更为敏感。
三、Treatments modulated the phyllosphere of phytopathogen-challenged tomatoes
在叶际微生物组分析中，研究人员从初始685个分类单元筛选得到67个高丰度分类单元，并构建系统发育树。结果显示，叶际细菌主要归属于变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidota），以前者为主，其中假单胞菌目（Pseudomonadales）和肠杆菌目（Enterobacterales）占重要比例。丰富度与总丰度分析表明，未受病原菌攻击的叶样本几乎不含可检测细菌16S rDNA，而病原菌攻击似乎促成了叶际多类细菌的出现与扩增。热图分析显示，在受病原菌攻击条件下，不同处理改变了细菌目水平相对丰度：A. brasilense Sp7与渗出物联用时，肠杆菌目相对丰度最高；A. brasilense Sp7与胞苷联用时，假单胞菌目显示特异性关联；而A. brasilense存在时，三组比较中黄单胞菌目（Xanthomonadales）丰度均低于相应未接种A. brasilense组。PCA结果显示，6个病原攻击处理组在主成分空间中分离明显，PC1和PC2累计解释91.08%的变异，说明处理可显著重塑叶际微生物结构，并形成处理组与特定细菌目之间的关联模式。
四、Treatments modulated the rhizosphere of phytopathogen-challenged tomatoes
根际分析从8619个分类单元筛选至280个高丰度分类单元，显示根际微生物多样性远高于叶际。主要类群包括α-、β-、γ-变形菌纲以及拟杆菌门、放线菌门（Actinobacteriota）等多个门类。与叶际不同，所有处理组根样本均检测到明显16S rDNA信号，且丰富度和总丰度在各组间未见显著差异，表明处理更多影响群落组成而非总体多样性水平。热图显示，根际优势菌目包括根瘤菌目（Rhizobiales）、假单胞菌目、伯克霍尔德菌目（Burkholderiales）、黄杆菌目（Flavobacteriales）和噬细菌体目（Bacteriovoracales）等。PCA分析进一步揭示，PC1方向的变异主要受A. brasilense Sp7存在或缺失影响：存在A. brasilense时，微球菌目（Micrococcales）、固氮螺菌目（Azospirillales）、Salinisphaerales和Microtrichales呈正相关；缺失A. brasilense时，则更倾向于与黄杆菌目、假单胞菌目、丙酸杆菌目（Propionibacteriales）、Saccharomonadales、根瘤菌目、Tepidisphaerales及Abditibacterales相关。尤其值得关注的是，A. brasilense接种提高了同属固氮螺菌目其他成员的丰度，这一结果提示接种菌可能在根际诱导了更广泛的谱系级群落重构。
讨论部分指出，本研究最核心的发现是A. brasilense Sp7与番茄幼苗渗出物或胞苷联用均能显著降低P. syringae pv. tomato DC3000引起的番茄病害严重度，其中胞苷协同作用最强。病害减轻并不伴随叶部病原菌数量下降，因此不支持“直接减少病原负荷”作为主要解释。相反，胞苷提升了根际A. brasilense Sp7丰度，提示其可能通过增强PGPR定殖促进植物整体健康，或诱导系统性抗性（ISR，induced systemic resistance）等防御反应。叶际和根际微生物组分析则表明，这种组合处理并非仅影响病原菌与接种菌之间的二元关系，而是重塑了番茄整体微生态系统。叶际中，渗出物和胞苷分别与不同细菌目富集相关；根际中，A. brasilense的存在成为群落差异的主导因素，并伴随固氮螺菌目其他成员丰度升高。研究人员据此认为，该组合处理具有作为番茄绿色生防策略的应用潜力。
研究结论部分可译为：
总之，A. brasilense Sp7与渗出物联用，或A. brasilense Sp7与胞苷联用，对由番茄植株和植物病原体P. syringae pv. tomato DC3000构成的研究体系产生了显著影响。一个首要观察结果是，这些处理可大幅降低病原菌引起的病害严重度。尽管目前尚缺乏对这种降低机制的充分解释，但病害症状的减轻似乎与胞苷存在条件下PGPR丰度增加相伴随，而这可能导致植物健康的整体改善，或产生更具特异性的效应，相关问题将于后续实验中继续研究。研究未观察到攻击病原菌丰度的下降。
