《Journal of Controlled Release》：T cell-mediated tumor suppression by a self-amplifying mRNA-based melanoma vaccine in a syngeneic mouse model
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作者：Hwayoung Na、Sung-Moo Lee、Seung-Hyeon Ahn、Hong Kyu Lee、Jinhee Lee、Kyung-Chul Choi
韩国忠清北道清州市忠清北国大学兽医学院生物化学与免疫学实验室
摘要
黑色素瘤是一种高度侵袭性的癌症，由黑色素
作者：Hwayoung Na、Sung-Moo Lee、Seung-Hyeon Ahn、Hong Kyu Lee、Jinhee Lee、Kyung-Chul Choi
韩国忠清北道清州市忠清北国大学兽医学院生物化学与免疫学实验室
摘要
黑色素瘤是一种高度侵袭性的癌症，由黑色素细胞的恶性转化引起。尽管有多种治疗选择，但其治疗仍然面临重大挑战，因此人们不断探索新的方法。在这项研究中，我们评估了基于自扩增mRNA（saRNA）的黑色素瘤疫苗候选物，这些疫苗针对黑色素瘤相关抗原（MAA）Melan-A，并评估了其免疫原性和有效性。这些候选物与脂质无机纳米颗粒（LIONs）结合后通过肌肉注射给药于小鼠体内。免疫原性通过酶联免疫吸附斑点试验（ELISpot）和酶联免疫测定（ELISA）进行评估。结果显示，其中一种候选物LS2-Melan-A（TM+），即saMelan-A/LION，通过产生针对Melan-A的免疫球蛋白G（IgG）抗体引发了体液免疫反应，而非T细胞介导的免疫反应。进一步的研究使用B16F10小鼠黑色素瘤模型评估了其治疗和预防效果。在治疗效果研究中，观察到saMelan-A/LION组肿瘤生长显著受到抑制。此外，荧光激活细胞分选（FACS）和免疫组化（IHC）显示CD8+/CD4+ T细胞比例以及肿瘤浸润的细胞毒性T细胞增加。在预防效果研究中，saMelan-A/LION通过诱导抗原特异性T细胞免疫反应显著延缓了肿瘤进展。ELISpot试验的结果表明，saMelan-A/LION组的Melan-A特异性T细胞反应显著增强，这与免疫原性研究的结果不同。这表明接种疫苗后通过肿瘤刺激再次接触抗原可以增强抗原特异性免疫反应。此外，FACS分析显示CD8+和CD4+细胞中的效应记忆T细胞比例增加。这些发现表明saMelan-A/LION具有作为黑色素瘤治疗和预防疫苗的潜力。
引言
黑色素瘤是一种由于黑色素细胞恶性转化而产生的高度侵袭性癌症。早期诊断的黑色素瘤患者5年生存率约为99%。然而，当癌症已发展到第3或第4阶段（即发生转移时），患者的生存期通常不超过5年[1] [2]。根据全球癌症观察站（一个提供全球癌症统计数据的网站）的数据，2022年报告了超过33万例新诊断的黑色素瘤病例，同年全球有超过5.8万人死于黑色素瘤[3]。此外，全球黑色素瘤的发病率一直在上升[4]。
黑色素瘤的治疗方法包括手术切除、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗。然而，由于以下限制，一些治疗方法的效果不佳：患者反应率低、药物相关不良反应、对治疗的耐药性发展以及黑色素瘤的免疫抑制微环境[5] [6] [7]。因此，最近研究了多种替代治疗策略。2019冠状病毒病（COVID-19）大流行后，mRNA疫苗的使用受到了广泛关注。因此，针对黑色素瘤的治疗性mRNA疫苗的研究也积极开展[8]。最近的研究主要集中在mRNA的有效递送策略上，而非其有效性[9] [10]。
迄今为止研究的大多数传统mRNA疫苗基于非复制型mRNA（nrRNA）。然而，nrRNA疫苗无法长期引发强烈且持久的免疫反应，因为免疫反应与给药剂量有关，且抗原表达时间较短[11] [12]。因此，针对肿瘤相关抗原（TAA）的nrRNA疫苗的有效性可能受到其对自身抗原的免疫耐受性或低免疫原性的限制[13] [14] [15]。为克服这些缺点，需要重复给药或与佐剂联合使用。虽然针对黑色素瘤抗原的传统mRNA疫苗已得到广泛研究，但自扩增RNA（saRNA）平台在这一领域的应用仍大多未被探索。本研究使用了一种编码目标抗原的saRNA，以及来自委内瑞拉马脑炎病毒的RNA依赖性RNA聚合酶[16]。与nrRNA疫苗相比，saRNA在低剂量下即可表达大量抗原蛋白并延长免疫反应持续时间[17] [18]。预计saRNA能够克服对TAA的免疫耐受性，并在增强抗癌免疫治疗效果中发挥关键作用[19]。
mRNA疫苗应用的一个重要方面是将其安全递送到目标细胞的同时保护其免受宿主RNase的破坏。因此，大多数先前的研究集中在有效的mRNA递送策略上，尤其是使用脂质纳米颗粒（LNPs）[20]。然而，使用LNPs作为递送系统可能会关闭宿主的翻译机制，因为纳米颗粒本身具有刺激先天免疫反应和随之而来的炎症的特性[21] [22]。因此，在需要重复或高剂量给药的情况下，使用LNPs作为mRNA载体可能不合适。另一方面，脂质无机纳米颗粒（LIONs）引发的先天免疫反应较弱，因此几乎不受剂量限制的影响。此外，与LNPs相比，它们引起的系统炎症最小[23]。
在B16F10小鼠黑色素瘤中表达的黑色素瘤相关抗原中，包括gp100、酪氨酸酶、TRP-1和TRP-2，选择Melan-A作为目标抗原，原因如下：首先，Melan-A是最广泛研究的黑色素瘤相关分化抗原之一，在大多数原发性和转移性黑色素瘤中都有表达，并已被广泛验证为癌症疫苗研究的目标[24] [25]；其次，B16F10小鼠黑色素瘤自然表达人类Melan-A的同源物，两者具有68.6%的氨基酸一致性，并且在同基因小鼠模型中证明了人类Melan-A与小鼠B16黑色素瘤之间的交叉反应性T细胞反应[26] [27]。这些特性使Melan-A成为基于saRNA的黑色素瘤疫苗开发的合理且具有翻译相关性的目标。
因此，本研究旨在制备基于saRNA的疫苗，这些疫苗含有LION，并在同基因小鼠模型中评估其对B16F10黑色素瘤的免疫原性和有效性。
章节片段
将Melan-A克隆到载体中
从HDT Bio公司（美国西雅图）获得了编码委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）复制子载体（TC-83株）的DNA质粒（受T7启动子控制）[28]。该质粒包含4个经过密码子优化的基因，包括Melan-A作为肿瘤抗原、两种类型的引导序列以及跨膜结构域的存在与否（GemeArt，德国）。这些基因使用In-Fusion HD克隆试剂盒被克隆到VEEV复制子载体的PflFI和SacII位点之间
生成针对Melan-A的黑色素瘤疫苗构建体
鉴于Melan-A在B16F10黑色素瘤中的高表达水平、作为广泛验证的疫苗目标的临床相关性以及人类和小鼠同源物之间的交叉反应性，选择Melan-A作为saRNA疫苗构建的目标抗原（详细理由见引言）。图1A展示了编码Melan-A的saRNA疫苗构建体的示意图。通过结合两种类型的引导序列生成了四种构建体
讨论
随着全球癌症相关死亡率的稳步上升，人们研究了多种抗癌治疗方法，包括癌症疫苗。然而，由于mRNA本身的特性使其在体内递送效率低且不稳定[38] [39]，mRNA疫苗作为癌症免疫疗法的研究一直处于边缘地位。为了克服这些限制，之前的mRNA疫苗研究集中在通过添加5′帽结构来提高mRNA稳定性上
CRediT作者贡献声明
Hwayoung Na：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、数据管理。Sung-Moo Lee：可视化、验证、方法学、研究、数据分析、数据管理。Seung-Hyeon Ahn：可视化、验证、方法学、研究、数据分析、数据管理。Hong Kyu Lee：撰写——审阅与编辑、验证、方法学、数据管理、概念化。Jinhee Lee：撰写——审阅与编辑、验证、资源管理。
资助
本工作得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助，该基金会由韩国政府（MSIT；RS-2026-25486352）支持。此外，本工作还得到了韩国区域创新系统与教育（RISE）计划的支持，该计划由教育部（MOE）和忠清北道（2025-RISE-11-014-03）资助的忠清北区域创新系统与教育中心实施。
致谢
作者衷心感谢HDT Bio公司（美国西雅图）提供DNA质粒，并就自扩增mRNA平台提供了宝贵的科学咨询。
