基于NanoBRET的神经肽FF受体1配体-受体相互作用检测

《RSC Advances》：NanoBRET-based detection of ligand–receptor interactions at the neuropeptide FF receptor 1

　　

神经肽FF受体1（NPFFR1）属于RF-酰胺G蛋白偶联受体家族，是治疗慢性疼痛的潜在药物靶点，但尚未进入临床应用。深入理解其配体结合及激活机制对于合理设计新型调节剂至关重要。研究人员开发了一种基于NanoBRET的非放射性配体结合检测方法，用于研究神经肽FF（NPFF）和神经肽VF（NPVF）与NPFFR1的相互作用。通过在配体特定位点偶联6-羧基四甲基罗丹明荧光基团，并在NPFFR1的N端融合纳米荧光素酶（Nluc）作为BRET供体，该方法实现了配体结合的定量测量，并揭示了配体与受体的相对取向。结果显示，NPFF与NPVF的BRET信号特征存在差异，其中NPVF的信号窗口较NPFF更小，提示二者结合取向不同。此外，删除受体N端前20个氨基酸后，不影响配体识别与结合。该检测方法同样适用于小分子配体如常春藤皂苷元（hederagenin）的结合分析，为探索亚型选择性提供了新途径，并将指导针对RF-酰胺受体家族的药物研发。

本研究发表于《RSC Advances》，针对神经肽FF受体1（NPFFR1）这一尚未成功转化为临床药物的潜在靶点，围绕其配体结合模式及检测方法展开。NPFFR1属于视紫红质样G蛋白偶联受体（GPCR），主要激活Gα_i/o通路，参与痛觉调节、血压调控、能量稳态等多种生理过程。尽管已有证据表明选择性NPFFR1拮抗剂可用于镇痛，但由于多肽类药物中枢渗透性差、小分子配体亲和力与选择性不足，至今无候选药物进入临床试验。传统配体结合检测依赖放射性标记，存在技术、监管与安全限制，因此亟需开发非放射性的活细胞检测方法。研究人员基于生物发光共振能量转移（BRET）原理，构建了N端融合纳米荧光素酶（Nluc）的NPFFR1，并合成多种荧光标记的NPFF与NPVF类似物，建立了可在活细胞中定量检测配体结合的新方法。

关键技术方法方面，研究人员采用固相多肽合成制备荧光标记配体，通过重叠延伸PCR将Nluc编码序列插入受体N端，并利用定点突变获得N端截短型受体。实验在HEK293细胞中瞬时转染受体及嵌合G蛋白Δ6Gα_qi4myr，分别开展钙离子动员功能检测与NanoBRET结合检测，并通过竞争结合实验验证小分子配体的作用模式。

研究结果部分，首先在“Tam标记NPFF与NPVF肽的活性”中，研究人员发现荧光基团的引入对NPVF活性的影响大于NPFF，推测是由于NPVF的N端与受体胞外环2（ECL2）的相互作用更易受空间位阻干扰。其次，“全长与截短型NPFFR1的NanoBRET配体结合检测”表明，截去受体N端前20个氨基酸可显著提高BRET信号窗口，并获得稳定的浓度-响应曲线，证实该区域不参与配体结合。再次，“拮抗剂常春藤皂苷元减少NPFFR1的肽结合”显示，常春藤皂苷元能有效竞争结合位点并降低BRET信号，证实其为正构结合模式。

讨论与结论部分指出，该研究成功建立了稳定、非放射性的NPFFR1配体结合检测平台，能够在活细胞环境中实时监测配体-受体相互作用，克服了传统放射性检测与冷冻电镜脱离细胞环境的局限。合适的连接链长度与化学性质是确保检测灵敏度的关键。虽然BRET最大信号受距离与取向共同影响，需要结合结构与功能数据进行综合解析，但该方法已证明适用于多肽与小分子配体的筛选与表征。研究结果为揭示NPFFR1配体结合机制提供了新工具，也为RF-酰胺受体家族的药物开发奠定了基础。