《RSC Advances》：The cocrystals of isorhamnetin and isoliquiritigenin with 4,4′-bipyridine: system characterization, stability, dissolution and anticancer activity
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异鼠李素（isorhamnetin, IRN）与异甘草素（isoliquiritigenin, ISL）作为两种天然产物，已被证实具有显著的抗癌活性。然而，诸多药学缺陷，如低溶解度和 poor bioavailability（生物利用度），阻碍了它们的抗癌疗效
异鼠李素（isorhamnetin, IRN）与异甘草素（isoliquiritigenin, ISL）作为两种天然产物，已被证实具有显著的抗癌活性。然而，诸多药学缺陷，如低溶解度和 poor bioavailability（生物利用度），阻碍了它们的抗癌疗效。为优化异鼠李素与异甘草素的抗癌疗效，本研究进行了科学的共晶设计，获得两种新制备的共晶。研究人员利用多种分析技术，包括单晶X射线衍射（single-crystal X-ray diffraction, SCXRD）、粉末X射线衍射（powder X-ray diffraction, PXRD）、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）、差示扫描量热法（differential scanning calorimetry, DSC）和热重分析（thermogravimetric analysis, TG），对异鼠李素-4,4′-联吡啶（2?:?3）和异甘草素-4,4′-联吡啶（1?:?1）共晶进行了系统表征。对其稳定性、溶出度和抗癌活性的一系列评价结果表明，这两种共晶在三种不同的极端环境下均能保持稳定，且异鼠李素-4,4′-联吡啶（2?:?3）共晶相较于异鼠李素，在溶解度、溶出速率和抗癌疗效方面均实现了显著改善。对于异甘草素-4,4′-联吡啶（1?:?1）共晶，其溶解度和溶出速率相较于异甘草素并未提高。尽管如此，共晶的形成仍使异甘草素的抗癌活性略有提升。该研究是一项有意义的探索，不仅为异鼠李素和异甘草素的开发奠定了创新型材料基础，也为优化天然产物药学性质提供了新策略。
癌症因其机制复杂、死亡率高、治愈率低、复发风险大、治疗周期长及治疗费用昂贵等特点，严重威胁着人类的生命健康。尽管已有多种抗癌药物可供使用，但许多化疗药物在治疗过程中会产生显著的毒副作用和耐药性，严重影响癌症患者的治疗进程和疗效。因此，开发高效低毒的抗癌药物极为迫切。天然产物是新药开发的重要宝库，其中黄酮类化合物因其药理作用温和持久、不良反应少以及多靶点、多效应、多功能的作?机制而备受关注。异鼠李素（isorhamnetin, IRN）和异甘草素（isoliquiritigenin, ISL）是两种典型的黄酮类化合物，具有显著的抗癌活性，但低水溶性和poor bioavailability（生物利用度）严重限制了它们的新药开发和临床应用。为解决这一难题，研究人员采用共晶技术对IRN和ISL进行优化，该技术被认为是一种简单、绿色、高效的策略，可通过氢键、静电相互作用和π–π堆积等非共价键自发构建有序超分子结构，具有载药量高、制备简单和环境友好等优势，能够优化压缩性、机械性能、稳定性、溶解度、渗透性和生物利用度，并降低药物毒性、改善治疗效果。
在本研究中，研究人员以4,4′-联吡啶（4,4′-bipyridine, 4,4′-BPY）为共形成物（coformer），成功制备了IRN-4,4′-BPY（2?:?3）和ISL-4,4′-BPY（1?:?1）两种新型共晶，并对其进行了系统的制备、表征、结构分析、稳定性、溶出度和抗癌活性研究，相关成果发表于《RSC Advances》。研究中所采用的主要关键技术方法包括：单晶X射线衍射（SCXRD）用于解析晶体结构；粉末X射线衍射（PXRD）用于物相鉴定和稳定性监测；傅里叶变换红外光谱（FTIR）用于识别氢键类型和确认共晶形成；差示扫描量热法（DSC）和热重分析（TG）用于热力学性质分析；高效液相色谱法（HPLC）用于体外溶出度实验中药物浓度的测定；以及CCK-8法用于A549肺癌细胞系的抗癌活性评价。
**SCXRD分析**
作为将微观原子排列转化为可视化三维模型的核心技术，SCXRD在本研究中提供了两种共晶的精确结构信息。IRN-4,4′-BPY（2?:?3）共晶属于三斜晶系P空间群，Z = 2，其不对称单元中含有2个IRN和3个4,4′-BPY分子，通过O5–H5?N1L（2.695 ?）和O6–H6?N3L（2.795 ?）氢键形成五元结构单元，相邻五元结构通过O5–H5?O6（2.835 ?）氢键沿a方向连接成链，再经O2–H2?O3（2.688 ?）氢键沿c方向进一步连接形成层状结构。ISL-4,4′-BPY（1?:?1）共晶则属于单斜晶系P2
1/c空间群，Z = 4，其不对称单元中含有1个ISL和1个4,4′-BPY分子，通过O4–H4?N1L（2.684 ?）和O2–H2?N2L（2.700 ?）氢键形成头尾相连的链结构，相邻链之间通过4,4′-BPY的两个吡啶环与ISL的A环和B环之间的错位平行π–π堆积沿a方向连接形成层状结构。两种共晶在空间群、晶系、晶格排布以及成晶作用力和氢键等方面存在显著差异，这与IRN与ISL的结构差异以及晶格排列中遇到的空间位阻密切相关。
**PXRD分析**
PXRD作为物质相态鉴定的"指纹"技术，在本研究中用于监测共晶生成后的相变情况。IRN的特徵衍射峰位于2θ = 9.19°、9.88°、10.45°等位置，4,4′-BPY的特徵衍射峰位于2θ = 12.48°、13.24°等位置，而IRN-4,4′-BPY（2?:?3）共晶的新特徵峰出现在2θ = 6.66°、9.59°、11.07°等位置。ISL的特徵衍射峰位于2θ = 7.14°、14.33°等位置，而ISL-4,4′-BPY（1?:?1）共晶的新特徵峰出现在2θ = 12.32°、13.84°、15.39°等位置。IRN、ISL和4,4′-BPY的特徵峰消失且新峰出现的事实证明了新晶相的生成，且两种共晶模拟粉末图与实验PXRD图的良好吻合进一步确认了共晶的形成。
**IR分析**
FTIR通过检测分子间相互作用引起的光谱位移来识别氢键类型并确认共晶形成。在IRN-4,4′-BPY（2?:?3）共晶中，O–H伸缩振动峰从IRN的3213 cm
?1红移至3057 cm
?1，C–O伸缩振动峰从1032 cm
?1红移至1030 cm
?1，C≡N伸缩振动峰从4,4′-BPY的1586 cm
?1红移至1558 cm
?1。在ISL-4,4′-BPY（1?:?1）共晶中，O–H伸缩振动峰从ISL的3378 cm
?1红移至3062 cm
?1，C–O伸缩振动峰从1031 cm
?1红移至1028 cm
?1，C≡N伸缩振动峰从1586 cm
?1红移至1556 cm
?1。这些红移现象进一步证实了氢键参与两种共晶的形成。
**热分析**
DSC检测结果表明，IRN-4,4′-BPY（2?:?3）共晶在216.13 °C出现尖锐吸热峰，显著不同于IRN（321.17 °C）和4,4′-BPY（114.11 °C）的吸热峰；ISL-4,4′-BPY（1?:?1）共晶在207.44 °C出现尖锐吸热峰，不同于ISL（202.48 °C）和4,4′-BPY（114.11 °C）的吸热峰，证明形成了新的高纯度固相。TG分析显示，IRN-4,4′-BPY（2?:?3）共晶在30–500 °C范围内有两步失重，第一步135–215 °C失重25.9%，第二步215–500 °C失重59.7%；ISL-4,4′-BPY（1?:?1）共晶则仅有一步失重，170–500 °C失重61.1%。两种共晶均未发现溶剂或水的失重步骤，表明不含任何溶剂或水。
**稳定性研究**
研究人员将两种共晶置于开放容器中，在高温（60 ± 2 °C）、高湿（25 ± 2 °C，90% ± 5%）和光照（4500 ± 500 lx）三种条件下考察5天和10天的稳定性。PXRD结果显示，在第5天和第10天，两种共晶的PXRD图在峰位、峰强、峰形和拓扑峰型方面几乎均无显著变化，表明IRN-4,4′-BPY（2?:?3）和ISL-4,4′-BPY（1?:?1）共晶在高温、高湿和光照条件下均能保持相同晶型稳定存在。
**体外粉末溶出度研究**
在pH 1.2、pH 4.5、pH 6.8和pH 7.0四种介质中，IRN-4,4′-BPY（2?:?3）共晶释放IRN的8 h最大浓度分别为1.521 ± 0.027、0.846 ± 0.068、0.432 ± 0.026和0.599 ± 0.114 μg mL
?1，1 h溶出速率分别为1.159 ± 0.098、0.255 ± 0.019、0.323 ± 0.023和0.327 ± 0.014 μg mL
?1 h
?1，分别是纯IRN最大浓度的7.3、7.4、4.0、5.3倍，1 h溶出速率的11.3、6.5、7.7、9.3倍，显著提升了IRN的溶出量和溶出速率。然而，ISL-4,4′-BPY（1?:?1）共晶在四种介质中8 h最大浓度分别为21.50 ± 0.23、25.30 ± 0.59、17.57 ± 0.76和17.08 ± 2.54 μg mL
?1，1 h溶出速率分别为13.29 ± 0.57、20.44 ± 0.30、14.12 ± 3.15和15.28 ± 0.31 μg mL
?1 h
?1，均未达到纯ISL的水平，表明该共晶未能改善ISL的溶解度和溶出速率。
**A549细胞系抗癌活性评价**
采用CCK-8法对A549人肺癌细胞系的抗癌活性评价结果显示，IRN、IRN-4,4′-BPY（2?:?3）共晶和物理混合物的细胞抑制率分别为14.1% ± 5.4%、40.7% ± 6.7%和25.5% ± 3.5%，IRN-4,4′-BPY（2?:?3）共晶相较于纯IRN和物理混合物均实现了显著改善（P < 0.01）。ISL、ISL-4,4′-BPY（1?:?1）共晶和物理混合物的细胞抑制率分别为30.4% ± 3.5%、38.7% ± 4.7%和25.4% ± 4.4%，ISL-4,4′-BPY（1?:?1）共晶相较于纯ISL和物理混合物也实现了统计学显著性提升（P < 0.01），但增幅较小。IRN-4,4′-BPY（2?:?3）共晶在抗癌活性增强程度上具有明显优势，这可能与其显著改善溶解度和溶出速率的潜力密切相关；而ISL-4,4′-BPY（1?:?1）共晶虽未能提高ISL的溶解度，但其抗癌活性略有提升，可能归因于改善了ISL的渗透性。
**结论**
与传统制剂策略如脂质体、包合物、固体分散体、胶束和纳米颗粒等不同，本研究基于晶体工程和超分子化学，通过科学的共晶设计来优化IRN和ISL的溶解度和抗癌活性，避免了载体和辅料的参与，实现了高载药量。研究采用挥发结晶法获得了IRN-4,4′-BPY（2?:?3）和ISL-4,4′-BPY（1?:?1）两种晶体结构，经PXRD、IR、DSC和TG等多种分析技术进行了权威表征和确认。结构分析结果表明，两种共晶在空间群、晶系、晶格排布以及成晶作用力和氢键等方面存在显著差异。通过PXRD、DSC和TG考察了两种共晶的相变和热力学性质。稳定性、溶出度和抗癌活性的一系列评价表明，两种共晶在三种极端条件下均能保持稳定，且均实现了抗癌活性的显著提升。该研究针对IRN和ISL在药物开发中的局限性，在不变更其原有结构的前提下，不仅验证了优化IRN和ISL药学性质的巨大潜力，也为推动高效低毒抗癌药物的开发开辟了新途径。
