CD4+调节性T细胞通过内皮YY1/MAML1再激活驱动缺血后芽生性血管生成

《Advanced Science》：CD4+ Tregs Drive Post-Ischemic Sprouting Angiogenesis via Endothelial YY1/MAML1 Reactivation

　　

糖尿病的微血管并发症是累及小血管的慢性疾病。研究人员此前发现，在小鼠和人类2型糖尿病（type 2 diabetes, T2D）缺血损伤后，CD4⁺调节性T细胞（regulatory T-cells, Tregs）显著减少，并且免疫缺陷小鼠中的Treg缺乏会损害血管再生。然而，Tregs如何对抗糖尿病性血管疾病的机制仍不清楚。本研究证实，内皮细胞（endothelial cells, ECs）在缺血后血管再生过程中上调转录因子YY1，但这种反应在糖尿病ECs中减弱。内皮特异性删除YY1会导致缺血后血管再生缺陷。在机制上，YY1与MAML1启动子结合，结合区域富集H3K4me3和H3K27ac。YY1激活MAML1转录，其方式很可能是招募H3K4me3写入酶SETD1A、MLL1、MLL2及其在COMPASS复合体中的支架蛋白WDR5，同时招募H3K27ac写入酶p300。从功能上看，Tregs即使在T2D小鼠中也可通过旁分泌信号增强血管再生。过继性Treg转移通过重新激活内皮YY1/MAML1轴恢复再生能力。这些发现确定了Treg-YY1-MAML1通路是内皮功能与血管修复的关键调节轴，并为Tregs如何在糖尿病相关微血管功能障碍中促进组织再生提供了机制性见解。

该研究发表于《Advanced Science》，聚焦糖尿病相关外周动脉疾病（peripheral arterial disease, PAD）中缺血后血管再生受损这一重要问题。芽生性血管生成是组织修复与再灌注恢复的核心过程，但在肥胖与2型糖尿病背景下，该反应显著减弱，导致严重肢体缺血、截肢风险升高及高死亡率。既往研究已表明，CD4⁺ Th1细胞和CD8⁺ T细胞在高糖环境下抑制血管生长，而CD4⁺调节性T细胞（Tregs）则具有促血管生成作用；然而，Tregs究竟通过何种分子机制改善糖尿病状态下的内皮修复能力，此前并未明确。基于这一背景，研究人员系统追踪了缺血后内皮转录调控网络变化，提出并验证了一个由免疫细胞驱动的内皮转录调节轴，即CD4⁺ Treg-YY1-MAML1轴。

研究首先从转录因子筛选入手，发现YY1是缺血后正常内皮细胞中显著上调、而在糖尿病内皮中无法充分诱导的关键因子。进一步研究表明，YY1并非仅参与胚胎期血管发育，而是在成年缺血环境下对内皮再生同样必不可少。无论是内皮YY1杂合缺失模型，还是诱导性内皮特异性敲除模型，均表现出缺血后血流恢复受损、内皮增殖下降以及体外成管能力减弱，说明YY1是成年缺血后血管再生的重要促进因子。临床相关性方面，单核RNA测序数据分析进一步证实，在非糖尿病PAD患者腓肠肌内皮细胞中，YY1同样呈上调状态，提示这一调控具有跨物种和人群的一致性。

在机制层面，研究人员通过ChIP-seq、RNA-seq及整合分析发现，缺血后YY1在成年内皮中的功能与既往胚胎发育阶段报道存在差异。此前有研究认为YY1通过与RBPJ结合抑制Notch信号，但本研究在成年内皮细胞中未检测到YY1-RBPJ相互作用。相反，YY1缺失会降低Maml1、Hes1、Hey1、Cdkn1a、Cdkn1b及Ccnd1等Notch相关调节因子或下游基因表达，提示在成年缺血内皮中，YY1更倾向于维持而非抑制Notch通路活性。尤其重要的是，MAML1被确定为YY1的直接转录靶基因。MAML1是Notch转录激活复合体的关键共激活因子，其表达水平对Notch输出具有速率限制作用，因此YY1对MAML1的调控构成了连接内皮信号应答与再生能力的核心节点。

作者为开展研究主要采用了以下关键技术方法：利用股动脉结扎建立小鼠后肢缺血模型，并结合激光多普勒成像评估灌注恢复；采用内皮特异性遗传修饰小鼠、AAV介导过表达和Treg过继转移开展体内功能验证；分离CD31⁺内皮细胞进行bulk RNA-seq、YY1 ChIP-seq、CUT&RUN-seq、ChIP-qPCR、co-IP、RT-qPCR和Western blot分析；在人胚胎干细胞来源内皮细胞（hESC-ECs）及原代小鼠肺内皮细胞中进行siRNA干预、双荧光素酶报告与成管实验；并结合公开的人腓肠肌单核RNA测序队列GSE233882进行临床相关验证。

2.1 YY1 is Markedly Upregulated in Healthy ECs, but not in Diabetic ECs, After Ischemic Injury
研究人员基于缺血组织来源内皮细胞转录组并结合ISMARA分析，鉴定YY1为缺血后内皮转录调控中的高评分候选因子。RT-qPCR和蛋白检测显示，非糖尿病小鼠内皮在缺血后明显上调Yy1/YY1，而Lepr_db/db糖尿病小鼠内皮中该反应缺失。公开人类单核RNA测序数据也显示，非糖尿病PAD患者腓肠肌内皮细胞YY1表达高于非PAD对照。该部分结论是：缺血诱导的内皮YY1上调是正常再生反应的一部分，而糖尿病状态下这一适应性诱导受损。

2.2 Endothelial YY1 is Essential in Vascular Regeneration After Ischemic Injury
研究人员构建Cdh5-Cre;Yy1^fl/+ 及Cdh5-CreERT;Yy1^fl/fl模型，证明成年内皮YY1不足会显著损害缺血后再灌注恢复。与此同时，YY1敲低的人hESC-ECs和来源于杂合缺失小鼠的原代肺内皮细胞均出现成管能力下降。该部分说明：内皮YY1不仅在分子上被缺血诱导，而且在功能上是驱动血管再生和血流恢复的必要因子。

2.3 Endothelial YY1 Inhibits Inflammation and Regulates Notch Signaling in Adult ECs
通过缺血与非缺血肢体来源内皮细胞YY1 ChIP-seq，研究人员发现YY1在启动子/转录起始位点附近广泛结合，且缺血后其结合谱发生重塑。将ChIP-seq与RNA-seq整合后发现，YY1缺失在缺血环境下导致大量炎症相关基因上调，包括先天免疫、巨噬细胞趋化、白细胞黏附和细胞因子产生相关通路，而与染色质重塑、内皮屏障和细胞迁移相关基因下调，说明YY1具有抗炎与维持再生转录程序的双重作用。与此同时，co-IP未检测到成年内皮中的YY1-RBPJ互作，但YY1缺失却降低多种Notch相关基因表达，并显著削弱缺血后内皮增殖。该部分表明：成年缺血内皮中YY1并非通过既往报道的YY1-RBPJ抑制复合体发挥作用，而是通过维持Notch相关转录输出并抑制炎症程序促进再生。

2.4 Endothelial YY1 Directly Regulates Maml1 Through Histone Modifications
围绕MAML1，研究人员进一步解析了YY1的直接转录调控机制。YY1 ChIP-seq及ChIP-qPCR证实YY1占据MAML1启动子；双荧光素酶实验表明删除YY1结合位点后，YY1对MAML1启动子的转录激活作用消失，且其中一个位点贡献更大。结合公开组蛋白修饰数据，研究显示YY1结合区域邻近H3K4me3与H3K27ac富集区。co-IP证实YY1与SETD1A、MLL1、MLL2、WDR5、p300及RNA pol II相互作用；YY1敲低会降低MAML1启动子上的H3K4me3、H3K27ac、SETD1A及p300占据，并减少MAML1转录。Maml1敲低抑制内皮成管，而AAV-Maml1过表达则可在YY1缺失小鼠中部分恢复缺血后再灌注。该部分结论是：YY1通过招募COMPASS相关H3K4甲基转移机制与p300介导的H3K27乙酰化机制，激活MAML1启动子，从而增强内皮再生能力。

2.5 CD4+ Tregs Promote Vascular Regeneration Through Activating Endothelial YY1/MAML1 in a Paracrine Manner
在上游调控层面，研究人员将注意力转向免疫微环境。过继转移来自NOD.Foxp3^hCD2小鼠的CD4⁺ Tregs后，无论在NOD.SCID小鼠还是高脂饮食诱导的糖尿病样NOD.SCID小鼠中，缺血后血流恢复均明显改善。体外共培养和Treg条件培养液实验显示，Tregs可通过旁分泌方式上调内皮YY1和MAML1。进一步筛选发现，Treg来源的GAS6、GRN和AREG均可促进内皮YY1/MAML1表达，且其作用依赖相应受体Axl、Epha2和Egfr。相反，体内清除Tregs会降低内皮YY1表达并损害再灌注；糖尿病小鼠则表现为这些Treg旁分泌因子表达下调、YY1在Maml1启动子上的占据减少。高糖并不直接抑制内皮YY1，而是削弱Tregs分泌营养因子的能力。最后，在内皮YY1缺失背景下，Treg过继转移对血流恢复和内皮扩增的促进作用大幅减弱。该部分明确证明：Tregs是缺血后诱导内皮YY1/MAML1轴的关键上游细胞来源，其促再生作用主要通过旁分泌信号实现，并依赖内皮YY1的存在。

综合讨论部分，研究建立了一个免疫调控内皮表观遗传转录程序的完整机制框架。缺血后，CD4⁺ Tregs在局部富集并分泌GAS6、GRN、AREG等旁分泌因子，经其受体激活内皮细胞中的YY1。上调后的YY1一方面抑制炎症相关转录程序，另一方面通过直接结合MAML1启动子并招募SETD1A/MLL复合体相关成分、WDR5、p300及RNA pol II，促进H3K4me3与H3K27ac沉积，增强MAML1转录，恢复Notch信号转录激活能力，最终促进内皮增殖、芽生性血管生成与缺血组织再灌注。糖尿病状态下，Tregs数量及其营养性旁分泌信号不足，导致YY1无法被充分诱导，MAML1转录激活受阻，进而造成血管修复障碍。该研究的重要意义在于，它将免疫调节、内皮转录因子YY1、表观遗传修饰和Notch共激活因子MAML1连接为统一通路，为糖尿病PAD提供了新的治疗思路，即通过Treg细胞治疗或增强YY1染色质共激活功能以恢复缺血后血管再生。

研究结论部分可译为：总之，缺血诱导并由CD4⁺ Tregs支持的内皮YY1上调，可通过表观遗传性激活MAML1而恢复Notch反应能力，并促进芽生性血管生成。该CD4⁺ Treg-YY1-MAML1轴在糖尿病中发生失调，从而导致血管修复受损。研究人员进一步证明，糖尿病PAD可通过CD4⁺ Tregs过继转移得到挽救，或可能通过治疗性增强YY1功能及其染色质共激活伙伴作用而获益。因此，YY1成为连接免疫信号、内皮染色质状态和Notch驱动血管生成程序的新型调节因子，并被提出为治疗糖尿病PAD的可行靶点。