靶向磷脂酶D3（PLD3）通过重编程肿瘤相关巨噬细胞逆转免疫抑制微环境并增强抗肿瘤免疫

《Advanced Science》：Targeting PLD3 Reverses the Immunosuppressive Niche by Reprogramming Tumor-Associated Macrophages and Potentiates Antitumor Immunity

　　

免疫检查点抑制剂（ICI）治疗错配修复 proficient 或微卫星稳定型（MSS）结直肠癌（CRC）面临的主要挑战在于肿瘤耐药性问题。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是介导这种耐药性的关键驱动因素之一。磷脂酶D3（PLD3）主要在巨噬细胞中表达，PLD3阳性巨噬细胞（PLD3⁺Macro）影响免疫治疗疗效和患者预后。研究人员旨在明确PLD3在调控巨噬细胞表型、CRC进展和免疫治疗反应中的作用，并筛选靶向PLD3的潜在药物。免疫荧光分析显示，PLD3⁺Macro的空间浸润动态决定了CRC的免疫治疗耐药性。研究人员构建了髓系特异性Pld3基因敲除小鼠，利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和流式细胞术描绘PLD3对肿瘤微环境（TME）的影响，通过RNA测序（RNA-seq）和质谱分析探索PLD3在巨噬细胞中的作用机制。通过分子对接联合肿瘤模型，研究人员评估了靶向巨噬细胞特异性PLD3在肿瘤进展和免疫治疗耐药中的治疗潜力。研究表明，PLD3通过调控溶酶体-AKT-NF-κB轴促进巨噬细胞衰老和抗炎表型，驱动从巨噬细胞到NK细胞和T细胞的失调串扰，最终形成免疫抑制性TME。相思子碱（Abrine）靶向巨噬细胞中的PLD3，有效增强CRC的免疫治疗反应。

该研究发表于《Advanced Science》，聚焦于结直肠癌免疫治疗耐药这一临床难题，系统阐述了磷脂酶D3（PLD3）在肿瘤相关巨噬细胞（TAM）中的调控作用及其机制。

研究背景与问题：免疫检查点抑制剂（ICI）已彻底改变错配修复缺陷（dMMR）或微卫星高度不稳定（MSI-H）型结直肠癌的治疗格局，然而错配修复proficient或微卫星稳定型（MSS）肿瘤对ICI存在显著耐药性。TAM是肿瘤免疫逃逸的关键介质，其高度异质性为开发靶向治疗带来重大挑战。既往研究虽已识别多种TAM亚群如SPP1⁺巨噬细胞、TREM2⁺巨噬细胞等，但结直肠癌中TAM的异质性仍需深入解析。公共数据库分析发现PLD3在结直肠癌TAM中显著过表达，且PLD3⁺Macro富集于免疫治疗反应差、预后不良的患者中，提示PLD3在构建免疫抑制性TME中发挥关键作用。

研究人员开展的研究及结论：研究人员通过整合临床样本分析、单细胞测序、基因工程小鼠模型、分子对接及药物筛选等多层面研究，证实PLD3⁺Macro是驱动结直肠癌免疫治疗耐药和肿瘤进展的关键亚群，其通过溶酶体-AKT-NF-κB轴诱导巨噬细胞衰老和抗炎表型，抑制细胞毒性T细胞、NK细胞和NKT细胞功能，形成免疫抑制微环境。小分子化合物相思子碱（Abrine）可特异性靶向巨噬细胞PLD3，重编程TAM至抗肿瘤表型，增强抗PD-1治疗效果。该研究为克服结直肠癌免疫治疗耐药提供了新靶点和治疗策略。

主要关键技术方法：研究采用了髓系特异性Pld3条件性敲除小鼠（Lyz2-Cre⁺; Pld3^flox/flox）构建皮下和原位肿瘤模型；利用scRNA-seq（DNBSEQ-T7平台）对肿瘤CD45⁺免疫细胞及CD45^?非免疫细胞进行单细胞转录组分析；通过MACS磁珠分选实现特定细胞群分离；整合RNA-seq与4D-DIA蛋白质组学进行多组学联合分析；运用分子对接（MOE和AutoDock）筛选PLD3抑制剂；采用Visium空间转录组学（GSE226997等公开数据集）解析细胞空间分布；借助流式细胞术进行免疫细胞表型分析；利用免疫荧光/多色免疫组化进行蛋白定位和共定位分析；通过Co-IP/MS结合AlphaFold3预测蛋白相互作用；应用多种生物信息学算法包括CytoTRACE、Monocle2、Slingshot、MiloR、hdWGCNA、SCENIC、CellChat、NicheNet、TIDE及CIBERSORTx等进行细胞轨迹、细胞通讯及免疫浸润分析。

研究结果：

PLD3⁺Macro促进免疫治疗耐药和不良预后：分析免疫治疗结直肠癌患者单细胞数据集（GSE236581）发现，疾病稳定（SD）患者髓系细胞浸润增加，其中PLD3⁺Macro和SPP1⁺Macro为优势亚群。PLD3⁺Macro高表达TAM标志物（TREM2、APOE、SPP1、C1QC、GPNMB、MS4A4A、APOC1）和抗炎标志物，与耗竭性CD8⁺ T细胞（CD8⁺Tex）丰度呈正相关。该亚群在肿瘤组织中富集，在CMS1和CMS4亚型中升高，在MSS样本中多于MSI-H样本。CytoTRACE算法显示PLD3⁺Macro具有高分化潜能，伪时序分析表明其定位于巨噬细胞分化终末阶段。TIDE算法提示PLD3⁺Macro高浸润组具有更高的免疫排斥和功能障碍评分。Kaplan-Meier分析证实高PLD3表达与多种癌症患者免疫治疗后更差的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）相关。空间转录组学和免疫荧光显示PLD3主要定位于肿瘤间质，与CD68和APOE共表达，且高浸润患者预后更差。

PLD3缺失逆转免疫抑制性肿瘤微环境并抑制肿瘤进展：构建髓系特异性Pld3敲除小鼠（Pld3^ΔMKO），在MC38皮下和原位肿瘤模型中观察到肿瘤生长受抑、生存期延长。scRNA-seq分析显示Pld3^ΔMKO肿瘤中巨噬细胞和单核细胞减少，而NKT细胞、T细胞和NK细胞增加，NKT和T细胞中抗原呈递及肿瘤杀伤效应通路激活增强。免疫组化和流式细胞术证实CD8⁺和CD4⁺ T细胞浸润增加。为排除中性粒细胞影响，研究人员通过多方法验证Pld3表达严格限制于巨噬细胞。

PLD3缺失激活T细胞抗肿瘤免疫以逆转免疫抑制性肿瘤微环境：空间转录组学显示PLD3⁺Macro与CD8⁺Tex空间共定位，而与效应性CD8⁺ T细胞（effectCD8T）呈空间互补。定量分析表明PLD3表达水平与到PD1⁺CD8A⁺ T细胞的空间距离呈负相关。NicheNet算法揭示PLD3⁺Macro通过IGF1-RPL、CCL2-TGFB1和APOE-VCAM1轴与CD8⁺Tex相互作用。Pld3^ΔMKO小鼠肿瘤中细胞间通讯增强，尤其巨噬细胞向NKT和T细胞的信号传递增加。体外实验显示THP-1来源巨噬细胞中PLD3敲低促进共培养Jurkat T细胞GZMB表达并下调PD1；鼠源巨噬细胞与脾CD8⁺ T细胞共培养证实Pld3敲除增强T细胞效应功能（Gzmb、Tnf、Ifng、Perforin）并降低耗竭标志物（Pd1、Tim3），体内分析得到一致验证。

PLD3缺陷巨噬细胞降低肿瘤相关巨噬细胞的抗炎表型：免疫荧光证实PLD3与ARG1和CD163共定位。scRNA-seq聚类分析显示Pld3^ΔMKO小鼠肿瘤中富集的巨噬细胞亚群表现出增强的促炎特征，而对照组富集的亚群显示抗炎标志物、抗原呈递和趋化因子分泌增强。CytoTRACE和hdWGCNA分析表明Pld3促进TAM抗炎炎性程序，SCENIC分析揭示E2f1、Nfkb1和Etv6在Pld3^ΔMKO中更活跃。scTenifoldKnk虚拟敲除分析显示PLD3缺失导致AGRN、PDLIM4、MYLK2、ADCY9和SIGLEC15等极化相关基因显著失调。RNA-seq和4D-DIA蛋白质组学联合分析证实Pld3敲除下调TAM标志物（Spp1、Trem2、Folr2、Mrc1、Gpnmb、Csf1r）表达。Western blot和RT-qPCR显示Pld3敲除下调抗炎标志物（Mrc1、Spp1、Apoe、Arg1）并上调促炎介质（Nos2、Cxcl9）。流式细胞术在体内外均证实Pld3敲除增加CD86和CD80表达，减少IL-10和CD206。Co-IP/MS筛选发现PLD3与多种TAM标志物（Csf1r、C1qb、Gpnmb、Apoc1、Folr2、Mrc1、Arg1）相互作用，AlphaFold3预测支持这一发现。

PLD3通过协调溶酶体-AKT-NF-κB轴发挥促肿瘤免疫抑制作用：通路富集分析显示Pld3与p53信号通路、细胞衰老、溶酶体和核苷酸代谢通路相关，而Pld3缺陷巨噬细胞中NF-κB信号、PI3K-AKT负调控和Toll样受体信号激活。免疫荧光证实Pld3与溶酶体蛋白Lamp2共定位，IL-4刺激促进M2极化并增强Lamp2表达，而Pld3敲除抑制Lamp2表达。p-Akt^(Ser473)与Lamp2在巨噬细胞中共定位，Pld3敲除抑制其表达及共定位。体内外验证Pld3敲除抑制AKT-NF-κB通路激活，AKT激动剂SC79可挽救Pld3敲除引起的通路损伤并恢复抗炎表型。

PLD3驱动细胞衰老通过AKT-NF-κB轴抑制抗肿瘤免疫：衰老小鼠巨噬细胞中AKT-NF-κB和p53衰老相关通路激活增强，伴随Lamp2和Pld3表达升高。Pld3^ΔMKO小鼠巨噬细胞衰老表型减轻。空间转录组学显示PLD3与衰老相关基因强空间共定位。肿瘤上清诱导巨噬细胞衰老表型，Pld3敲除抑制p53通路激活并缓解肿瘤上清诱导的衰老。SC79通过AKT激活恢复Pld3敲除减弱的衰老相关分泌表型（SASP）。

Abrine通过靶向肿瘤相关巨噬细胞PLD3增强抗肿瘤免疫：基于CTD数据库和分子对接（MOE、AutoDock）鉴定Abrine为PLD3高亲和力结合小分子。CCK-8实验证实≤40μM Abrine对RAW264.7细胞毒性低于20%。Abrine抑制Pld3表达，下调Apoe、Mrc1和Arg1，上调Nos2。与IDO抑制剂联合处理表明Abrine对PLD3的抑制作用独立于IDO途径，且在Pld3缺陷巨噬细胞中Abrine不再显著改变抗肿瘤表型。体内实验显示Abrine显著抑制MSS皮下肿瘤生长、延长生存期、降低Ki67指数。流式细胞术证实Abrine下调肿瘤相关巨噬细胞Pld3表达，上调CD86和CD80，同时CD8⁺ T细胞效应分子上调、耗竭标志物下调。RT-qPCR显示Abrine降低Pld3、Arg1、p65和Apoe mRNA水平，且未引起显著器官损伤。

Abrine重编程巨噬细胞重塑免疫微环境增强抗肿瘤免疫：Abrine处理Pld3^fl/fl小鼠的scRNA-seq显示NKT、T和NK细胞比例增加，并确认Abrine特异性靶向TAM中Pld3。细胞通讯分析显示Abrine增强细胞亚群间整体通讯强度，尤其增强巨噬细胞向NKT和T细胞的信号传递，效果甚至超过Pld3^ΔMKO，同时增强对树突状细胞的信号输入。巨噬细胞亚群分析显示Abrine和Pld3^ΔMKO均减少抗炎因子表达，降低巨噬细胞分化可塑性，富集NF-κB信号通路，减弱衰老表型。

靶向PLD3与免疫治疗协同增强抗肿瘤疗效：MC38皮下肿瘤模型中，Pld3髓系敲除、Abrine单药、抗PD-1单药及联合治疗均显著抑制肿瘤生长并延长生存，其中Abrine联合抗PD-1效果最优且缓解肿瘤负荷导致的体重下降。联合治疗进一步增强CD8⁺ T细胞浸润。MC38 MSI-H和CMT93 MSS原位盲肠种植模型证实Abrine和抗PD-1均抑制肿瘤生长，且Abrine增强PD-1阻断疗效，联合处理进一步减少巨噬细胞浸润、促进NK和CD8⁺ T细胞浸润。安全性评估显示Pld3敲除、Abrine及抗PD-1处理均未引起重要器官显著损伤。

讨论部分：该研究确立了PLD3⁺Macro作为结直肠癌免疫逃逸关键调控者的地位。PLD3通过溶酶体-AKT-NF-κB轴诱导巨噬细胞衰老和免疫抑制表型，抑制细胞毒性免疫浸润并促进抗PD-1耐药。相思子碱靶向巨噬细胞PLD3可恢复抗肿瘤免疫并与抗PD-1治疗协同增效。

研究结论：研究阐明了PLD3在结直肠癌TME中的影响，为克服免疫治疗耐药提供了新的治疗靶点和策略。