受发育启发的基于iPSC原位分化与形态发生的人多细胞心脏组织生物打印

《Advanced Science》：Developmentally Inspired Bioprinting of Nascent Multicellular Human Heart Tissue Through in Situ Differentiation and Morphogenesis of iPSCs

　　

当前心脏组织生物打印通常采用已在二维(2D)培养中预分化的诱导多能干细胞(iPSC)来源心肌细胞，这与胚胎心脏发育存在本质差异——胚胎心脏发育过程中，中胚层祖细胞是在三维(3D)、富含基质且具有形状形变特性的微环境中分化为心肌细胞。本研究提出一种受发育启发的策略，可在生物打印的、具有形状形变特性的多能组织内部实现iPSC的中胚层和心脏原位分化。研究人员采用嵌入式生物打印技术，将负载高密度iPSC悬液的Matrigel生物墨水沉积至颗粒支撑水凝胶中，构建具有明确结构的多能组织构建体。这些构建体表现出形状形变行为，可通过调控支撑浴的粘弹性进行调节。支撑浴力学特性同时调控iPSC命运，较软的配方可降低自发分化。在此基础上，研究人员通过时序调控WNT通路，直接在形变构建体中驱动中胚层和心脏分化，最终获得多细胞心脏组织，其中心肌细胞与成纤维细胞共源于同一祖细胞池。这些新生心脏组织呈现发育表型，免疫荧光与基因表达谱分析显示其同时存在心脏祖细胞与成熟中的心肌细胞。综上，本研究揭示了替代性发育生物制造范式的潜力，该范式聚焦于打印可复现胚胎发育早期特征的多能器官原基，通过程序化的原位谱系定向与形状形变实现。

论文解读

研究背景与意义

现有心脏组织生物打印普遍依赖二维预分化的诱导多能干细胞(iPSC)来源心肌细胞(iPSC-CM)，这一模式与胚胎心脏发育的天然轨迹存在根本偏差：胚胎中心脏祖细胞的分化发生在三维、基质丰富且力学环境动态演变的微环境中，而预分化策略需将细胞解离后重包埋，破坏了天然的细胞-基质、细胞-细胞互作，且支持细胞（如成纤维细胞、内皮细胞）多采用独立分化方案，缺失发育过程中的协同信号交流。尽管心脏类器官研究已实现iPSC原位分化并获得多细胞心脏组织，但类器官缺乏几何可控性与 scalability。本研究由爱尔兰研究团队完成，发表于《Advanced Science》，旨在构建一种贴合胚胎发育特征的生物打印范式，同步实现多能组织构建、原位分化与形态发生，为心脏组织工程提供更仿生的解决方案。

关键技术方法

研究采用人iPSC系A18945（Fisher Scientific），通过嵌入式生物打印技术将高密度iPSC悬液与Matrigel生物墨水沉积至琼脂糖颗粒支撑浴中构建初始结构；通过调控支撑浴的微凝胶堆积密度（100%、80%、60%）调节力学特性，筛选维持多能性且支持形变的优化条件；采用改良GiWi方案时序调控WNT通路（CHIR99021激活、IWP-4抑制）实现原位中胚层与心脏分化；结合免疫荧光染色、qRT-PCR、钙成像、收缩功能分析等手段表征细胞命运与组织功能；通过冷冻切片分析空间分布特征，转录组测序评估分化成熟度。

研究结果

2.1 颗粒支撑水凝胶中的iPSC生物打印

研究人员将iPSC以1.5×10⁸cells/mL的高密度悬浮于Matrigel生物墨水中，在6–8°C下维持液态以实现挤出，嵌入热稳定的琼脂糖颗粒支撑浴后，打印结构在37°C下保持稳定。结果显示，该密度下构建体7天存活率达90%，且细胞快速聚集形成致密连接，维持OCT4、SOX2等多能性标记表达与Ki67增殖活性；胶原仅生物墨水无法实现细胞聚集，混合生物墨水与纯Matrigel均支持良好存活与结构完整性，最终选择纯Matrigel配方开展后续实验。

2.2 生物打印iPSC构建体的形状形变

颗粒支撑浴的粘弹性允许构建体发生细胞驱动的形变：Matrigel基构建体形变程度显著高于胶原组，细胞密度从5×10⁷cells/mL提升至1.5×10⁸cells/mL时形变显著增强。支撑浴刚度调控形变幅度：60%堆积密度（储能模量≈105 Pa）的软支撑浴中梁状构建体形变达65%，而100%堆积密度（储能模量≈501 Pa）的硬支撑浴中仅13%；环状构建体因几何约束，各刚度下形变均低于4%。

2.3 支撑浴力学对形变构建体中iPSC命运的影响

软支撑浴可有效维持多能性并减少自发分化：7天培养后，60%堆积密度组中多能性基因OCT4、Nanog分别仅下降21%、70%，外胚层标记OTX2表达显著低于硬支撑浴组；移除支撑浴后，构建体仍维持多能性，Ki67表达在3–7天升高82%，表明细胞持续增殖。硬支撑浴因限制形变，显著上调OTX2表达，提示力学约束可引导iPSC向非心脏谱系偏向。

2.4 构建体内原位中胚层与心脏谱系定向

研究人员在打印后第3天加入GSK3抑制剂CHIR99021激活WNT通路，成功诱导中胚层标记Brachyury(T)上调约35倍，且未出现外胚层、内胚层标记异常表达。随后时序加入WNT抑制剂IWP-4，构建体在8–12天开始出现自发收缩，收缩频率约0.8 Hz，对β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素呈正性变时与变力反应趋势；钙成像显示同步的钙瞬变活动，钙瞬变时程为309–752 ms。免疫荧光与qRT-PCR验证心肌细胞标记（cTnT、TNNT2、MYH7等）显著上调，同时存在心脏祖细胞标记（HAND1、NKX2.5），且以心室样亚型（IRX4阳性）为主。细胞共涌现分析显示，成纤维细胞（vimentin、DDR2阳性）与心肌细胞共同来源于同一祖细胞池，内皮细胞分化较少。空间分析发现，心脏祖细胞标记均匀分布于整个构建体，而终末分化的心肌细胞主要位于距表面100 μm内的区域，核心区仍保留祖细胞表型，推测与氧/营养扩散限制有关。

讨论与结论

研究证实，支撑浴力学特性可独立调控iPSC命运与组织形变，软支撑环境是维持多能性的关键；时序WNT调控可实现原位心脏分化，且分化过程与形态发生同步，复现了胚胎早期心脏发育的核心特征。本策略避免了预分化细胞的解离损伤与谱系异步问题，获得的组织具有内源性成熟潜力，为心脏再生医学提供了新范式。局限性在于终末分化存在空间异质性，后续需整合可灌注血管网络、优化分化方案以提升均匀性。结论指出，这种受发育启发的生物打印策略是一种替代传统二维预分化范式的新路径，可构建具有内源性结构成熟能力的多细胞新生心脏组织。