负载多酚铠甲纳米基因的可注射生物粘附水凝胶通过重塑衰老软骨细胞微环境治疗老年骨关节炎

《Advanced Science》：Bioadhesive Hydrogel With Polyphenol-Armored Nanogene Rejuvenates Chondrocyte Senescence for Aged Osteoarthritis Therapy

　　

软骨细胞衰老是衰老及细胞应激加剧驱动老年骨关节炎（Osteoarthritis, OA）进展的核心病理特征，可导致代谢失衡。目前，实现软骨细胞衰老的持续抑制并同步缓解多重细胞应激因素仍是老年OA治疗的难点。本研究开发了一种可注射、兼具生物粘附与润滑功能的水凝胶，其内部封装了负载miR-140-5p（简称miR-140）的多酚铠甲纳米颗粒，用于逆转老年OA中的软骨细胞衰老。该水凝胶利用儿茶酚基团牢固锚定在软骨组织表面，不仅能持续降低关节摩擦系数，还可作为纳米颗粒的局部储库，延长其在恶劣关节腔内的滞留时间。纳米颗粒表面的多酚铠甲可在富含核糖核酸酶（RNase）与活性氧（ROS）的衰老微环境（Senescence Microenvironment, SME）中保护miR-140的活性，防止药物提前泄漏，并通过克服细胞外基质、细胞膜及溶酶体多重屏障显著提升转染效率，进而下调软骨细胞的衰老相关信号通路。此外，多酚铠甲具有类过氧化氢酶（Catalase, CAT）和类超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）活性，可通过靶向清除ROS改善线粒体功能障碍。综上，该水凝胶在老年大鼠OA模型中有效减轻了软骨细胞衰老并延缓了疾病进展，显示出巨大的临床应用前景。

研究背景与意义

老年骨关节炎（OA）是一种年龄依赖性的退行性关节疾病，65岁以上人群发病率显著升高，给患者健康及社会医疗体系带来沉重负担。软骨细胞衰老是老年OA的标志性特征，表现为端粒损耗、信号分子失调、线粒体功能障碍导致的活性氧（ROS）积累，以及衰老相关分泌表型（SASP）因子的过度产生。这些因子共同构建了衰老微环境（SME），促使软骨稳态由合成代谢向分解代谢偏移，最终导致关节软骨进行性退变。miR-140是维持软骨稳态的关键调节因子，可通过靶向组蛋白去乙酰化酶（HDAC）-4及Smad信号抑制软骨肥大，并通过作用于胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）-5抑制细胞外基质降解，同时能通过下调PI3K-p53信号轴有效抑制软骨细胞衰老。然而，外源性miR-140治疗面临巨大挑战：在富含RNase和ROS的SME中易降解；易被关节腔内血管及淋巴系统快速清除；带负电的软骨细胞外基质（ECM）、细胞膜及溶酶体构成多重生物屏障，导致生物利用度极低。尽管可注射水凝胶是潜在的基因递送平台，但现有体系普遍存在对软骨组织粘附力不足、无法在SME中全程保护基因药物、且忽略了关节润滑不足及线粒体功能障碍等关键致病因素。因此，亟需开发一种集增强的组织粘附、长效精准基因递送及靶向ROS清除于一体的水凝胶系统。

针对上述问题，研究人员受多酚化学启发，开发了一种可注射、生物粘附且具有润滑功能的复合水凝胶系统，封装了负载miR-140的多酚铠甲纳米颗粒，用于综合干预老年OA。该研究发表于《Advanced Science》。

关键技术方法

研究人员首先采用层层自组装法制备了多酚铠甲纳米颗粒，以氨基介孔二氧化硅纳米颗粒（nMSN）负载miR-140，交替沉积聚多巴胺-铁（PFe）层与修饰了II型胶原靶向肽WYRGRL的壳聚糖（CSWY）层。随后将纳米颗粒掺入由多巴胺修饰的氧化透明质酸（OHA-DA）与己二酸二酰肼修饰的透明质酸（HA-ADH）组成的动态交联聚合物基质中，形成复合水凝胶。研究使用了15月龄老年SD大鼠建立前交叉韧带切断（ACLT）诱导的OA模型，并通过显微CT、组织学染色、蛋白质组学等手段评估疗效与机制。

研究结果

2.1 设计策略

研究设计了具有核壳结构的nMSN@140-(PFe/CSWY)₃纳米颗粒，其表面正电荷及抗氧化酶活性由多酚铠甲提供。水凝胶通过动态酰腙键和亚胺键形成，兼具可注射性、组织粘附性及润滑性。该体系可在关节腔内原位成胶，作为纳米仓库响应酸性SME释放纳米颗粒，通过靶向递送、保护基因、清除ROS及促进转染等多重机制逆转软骨细胞衰老。

2.2 多酚铠甲纳米颗粒的表征

扫描电镜（SEM）与透射电镜（TEM）证实纳米颗粒呈球形，直径约100 nm，成功构建了厚度约15 nm的核壳结构。Zeta电位及X射线光电子能谱（XPS）验证了逐层组装过程及铁离子的螯合。多酚铠甲显著延缓了miR-140在生理环境下的突释，且在模拟溶酶体酸性环境（pH 4.5）下可分解以释放药物。

2.3 多酚铠甲纳米颗粒的抗氧化酶活性

体外实验表明，随着PFe层沉积周期增加，纳米颗粒对DPPH自由基、超氧阴离子（•O₂^?）的清除能力及催化过氧化氢分解为氧气的能力显著增强，证实了其具有显著的类CAT和类SOD活性，且主要归因于PFe组分中铁的可逆价态转变与儿茶酚基团的协同作用。

2.4 载纳米基因水凝胶的可注射性

核磁共振（¹H NMR）证实了聚合物前体的成功合成。该水凝胶前体可通过26 G针头顺利注射并在数秒内原位凝胶化，形成多孔结构包裹纳米颗粒，凝胶时间约为4秒，具备微创给药所需的流变学性能。

2.5 水凝胶的力学性能

得益于纳米增强效应，复合水凝胶的压缩强度（36.4 kPa）和韧性（2.6 kJ/m³）分别为纯水凝胶的2.1倍和1.7倍。同时，基于动态共价键的自愈合特性使其能承受关节内的反复载荷。

2.6 水凝胶的粘附与润滑性能

得益于儿茶酚基团的作用，复合水凝胶对软骨组织的搭接剪切强度达5.3 kPa，界面韧性达22.0 J/m²，均显著高于无粘附基团对照组。摩擦系数（COF）低至0.06，且纳米颗粒的引入未增加摩擦阻力。

2.7 SME响应释放与体内滞留

水凝胶在酸性SME（pH 6.5）下的纳米颗粒释放速率快于生理环境（pH 7.4）。活体成像显示，负载于水凝胶中的Cy5.5标记纳米颗粒在关节腔内的滞留时间延长至至少14天，而未封装的游离纳米颗粒则在14天内被完全清除。

2.8 体外细胞相容性与基因转染

细胞实验证实该水凝胶具有良好的细胞相容性。多酚铠甲通过正电荷介导的质子海绵效应促进纳米颗粒从溶酶体中逃逸，并显著提高了miR-140的转染效率。经优化，3个沉积周期的纳米颗粒转染效率最高。此外，多酚铠甲能有效屏蔽RNase并清除ROS，保护miR-140免受降解。

2.9 缓解线粒体功能障碍

纳米颗粒可靶向富集于线粒体，清除叔丁基过氧化氢（TBHP）刺激产生的过量线粒体ROS（mtROS），并将线粒体膜电位恢复至接近正常水平，有效改善了线粒体功能障碍。

2.10 体外抗衰老作用

该体系显著降低了衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）的活性，下调了p21和p16等衰老标志物及SASP因子（如IL-6、TNF-α、ADAMTS5）的表达，同时上调了II型胶原（Col-II）等合成代谢标志物，重塑了软骨细胞的代谢平衡。

2.11 水凝胶治疗老年OA的效果

在15月龄老年大鼠OA模型中，单次注射该水凝胶可有效抑制骨赘形成，保护软骨下骨微结构，维持关节软骨完整性。组织学分析显示其显著降低了p21阳性细胞比例及IL-6、MMP-13的表达，同时促进了Col-II的合成，有效阻断了OA进展。

2.12 水凝胶的作用机制

蛋白质组学分析显示，水凝胶处理组与OA组存在2244个差异表达蛋白。基因本体论（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析表明，该水凝胶主要通过抑制p53信号通路、细胞衰老通路、NF-κB信号通路及糖胺聚糖降解通路发挥治疗作用。机制总结为：基因调控抑制衰老通路、靶向清除mtROS改善线粒体功能、提供润滑减少机械应力三重协同作用。

讨论与结论

讨论部分指出，相较于可能引起健康细胞损伤的清除衰老细胞疗法（Senolytics），本研究采用的衰老表型调控疗法（Senomorphics）安全性更高。该水凝胶系统解决了传统递送系统中药物易失活、滞留时间短及生物屏障穿透难的问题，并首次将粘附润滑、基因递送及靶向抗氧化有机结合。结论部分强调，这种集成了生物粘附、长效润滑、基因保护与递送、靶向mtROS清除的多功能水凝胶，在老年OA治疗中展现出卓越的综合疗效与临床转化潜力。