利用深共晶溶剂技术提高从柑橘废弃物中发酵生产γ-聚谷氨酸的效率

《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Enhanced fermentative production of γ-polyglutamic acid from citrus waste by deep eutectic solvent technology

　　

李家斌|李春霞|赵月欣|李秀芬|华兆哲|齐希光

江南大学环境与生态学院环境生物技术实验室，中国无锡214122

摘要

通过微生物发酵将柑橘废弃物转化为γ-聚谷氨酸（γ-PGA）的过程中，纤维素糖化仍是一个限速步骤，这主要是由于顽固的木质素-碳水化合物复合物包裹了纤维素纤维。本研究开发了一种可发酵的柠檬酸-甘油深共晶溶剂（CG-DES）用于柑橘废弃物的预处理。优化后的CG-DES在80℃下处理2小时后，木质素溶解率达到64.19%，并且加热后粘度降低了13.6倍，从而促进了溶剂的渗透和传质。针对性的皂化作用逆转了CG-DES引起的纤维素酯化，使纤维素降解率从25.21%提高到了47.02%。没有丢弃预处理液，而是将其与固体残渣一起共同发酵。这种集成方法使纤维素降解率达到49.74%，γ-PGA的最大产量达到了40.47克/千克（基于未经处理的废弃物的干重），分别比未经处理的对照组提高了160.56%和132.59%。CG-DES在五个循环中表现出优异的可回收性，同时保持了有效的生物质分离效果。多尺度结构表征显示，CG-DES预处理破坏了包裹纤维素的物理屏障，提高了纤维素的可及性和纤维素酶的吸附能力，而液体组分中的内在营养物质增强了微生物的碳代谢。整体增强机制被确定为酸解、渗透膨胀和代谢调节的结合，为高效利用柑橘废弃物提供了一个战略性的生物精炼框架。

引言

γ-聚谷氨酸（γ-PGA）是一种通过谷氨酸单体中的α-氨基和γ-羧基之间的酰胺键形成的天然生物聚合物，具有优异的生物相容性、可降解性和保水性。它在食品、医药、农业和环境领域有广泛的应用（Bajaj等人，2011年）。在农业中，γ-PGA可以增强干旱条件下的土壤保水能力和根系发育，其水凝胶形式可作为缓释肥料的载体，以减少养分损失[46]。目前，γ-PGA的生产主要依赖于使用葡萄糖和L-谷氨酸的Bacillus发酵，然而这些原材料占总成本的60-70%[20]，限制了大规模生产。木质纤维素生物质（LCB）提供了一种可再生且低成本的替代品[21]。虽然各种LCB仅作为碳源使用，需要额外添加昂贵的氮和特定前体[20]，但柑橘废弃物是一种综合性的底物，不仅含有可发酵的碳（可溶性糖和纤维素），还含有与γ-PGA合成相关的氮化合物和代谢前体（Satari等人，2018年）。这种独特的组成使柑橘废弃物成为开发更经济高效γ-PGA生产过程的有希望的候选材料。

通过微生物发酵将木质纤维素废弃物转化为γ-PGA的过程中，纤维素糖化仍然是限速步骤（Okuofu等人，2024年）。纤维素的结晶结构和广泛的氢键网络与半纤维素和果胶形成了密集的基质，这些成分进一步与木质素交联，生成了顽固的木质素-碳水化合物复合物（LCC）[27]。这种物理屏障严重限制了水解酶和微生物的渗透，从而限制了糖化过程。传统的预处理技术如热水解、酸碱处理、微波处理和蒸汽爆炸可以破坏这一屏障[32]，但存在效率和可持续性的挑战[8]。例如，虽然蒸汽爆炸（160℃，5分钟）使纤维素水解率达到32.81%，但产生的富含精油的预处理液会抑制后续的发酵，导致资源浪费和二次污染（Boluda-Aguilar等人，2013年）。同样，酸碱处理和微波处理常常会降解内源性的柠檬酸和糖分，直接影响发酵产量[11]。因此，迫切需要开发一种新的预处理策略，既能有效分离生物质，又能保持固体和液体相的化学完整性和可发酵性，以实现γ-PGA的生物制造。

深共晶溶剂（DESs）是由氢键供体（HBD）和受体（HBA）按特定摩尔比合成的绿色溶剂，具有可设计性、低毒性和生物降解性[33]。此外，与传统的蒸汽爆炸和稀酸预处理方法相比，DES预处理在条件上更为温和，所需的能量输入更低，产生的抑制性副产物也更少[36]。通过破坏纤维素-半纤维素-木质素基质中的广泛氢键网络，DESs选择性地溶解木质素并破坏纤维素的物理屏障，从而暴露出水解酶的结合位点，促进后续的生物降解[33]。例如，用CTAB/乙二醇DES预处理油菜秸秆后，木质素溶解率达到62.2%，纤维素的酶解速率提高了46%[30]。同样，用氯化胆碱/乳酸DES预处理的微藻液相支持了Lipomyces starkeyi发酵生产1.2克/升的微生物脂质[41]。常见的HBD（如甘油、蔗糖、尿素）和HBA（如甜菜碱、柠檬酸）本身就可以作为合成高价值产品的微生物底物。大多数DES预处理研究关注生物质的分离，而忽视了液体相的下游命运以及DES组分作为微生物底物的潜力，这一差距限制了生物质的充分利用。

为了解决这一限制，我们使用γ-PGA前体柠檬酸和微生物可利用的甘油分别作为HBA和HBD，合成了一种可发酵的柠檬酸-甘油DES（CG-DES）。在本研究中，CG-DES的设计目的不仅仅是为了最大化木质素的去除，而是为了平衡生物质的分解和发酵的兼容性，使固体和液体组分都能为γ-PGA的生产做出贡献。因此，我们评估了CG-DES预处理在提高纤维素可及性方面的效果，同时保持液体相的可发酵性，以实现固液一体化利用。最后，通过对预处理前后柑橘废弃物的全面形态学、化学和结构分析，我们研究了支持纤维素转化和γ-PGA合成的预处理相关变化。本研究提出了一种用于柑橘废弃物增值的集成预处理-发酵策略。

部分摘录

材料

使用的是在加工/储存过程中变质的柠檬废弃物（来自中国重庆），样品被切块、在60℃下脱水、粉碎并过60目筛子后储存。原始废弃物的化学组成为：22.54%的纤维素、9.35%的半纤维素、3.63%的木质素、23.89%的果胶、9.62%的蛋白质和13.04%的可溶性糖，C/N比为30.67，pH值为3.15。

合成的微生物群落包括Bacillus siamensis L07、Bacillus subtilis S04和Bacillus amyloliquefaciens S07

CG-DES制备过程的优化

在柑橘废弃物预处理中，木质素的去除是限制酶作用的主要障碍[19]。DES预处理的效率很大程度上取决于HBA: HBD的摩尔比，该比例调节了溶剂网络中的氢键强度。在2:1的CA: Gly比例下，木质素溶解率达到47.74%（图1a）。然而，这也增加了溶剂的酸度（见补充材料），降低了CG-DES的流动性，并增加了传质阻力[39]。减少

结论

本研究建立了一种可发酵的CG-DES策略，用于柑橘废弃物的综合增值，该策略既可以作为生物质分离溶剂，也可以作为γ-PGA生物合成的代谢兼容营养源。该策略使木质素溶解效率达到64.19%，同时固体残渣中保留了77.63%的纤维素。固体和液体组分的共同发酵使纤维素降解率和γ-PGA产量分别比未经处理的提高了160.56%和132.59%

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赵月欣：可视化、验证。李秀芬：写作——审稿与编辑、软件、资源获取、概念化。华兆哲：方法学、概念化。齐希光：监督、资源。李家斌：写作——审稿与编辑、初稿撰写、方法学、调查、数据分析、概念化。李春霞：可视化、验证、数据分析。

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。作者是[期刊名称]的编委会成员/主编/副主编/客座编辑，并未参与本文的编辑审查或发表决定。

致谢

本工作得到了重庆市生态环境局研究项目（2023-003）和江苏省研究生研究与实践创新计划（编号KYCX24_2601）的财政支持。