《Advanced Science》：Nanozymes for Advanced Hemoglobin-Based Oxygen Carriers: Applications in Blood Substitution, Wound Healing, Antitumor Therapy, and Beyond
氧输送与活性氧（reactive oxygen species, ROS）调控在生理过程中紧密关联，红细胞（red blood cells, RBCs）既承担氧转运功能，又是关键的抗氧化屏障。这种双重功能推动了数十年来对血红蛋白（hemoglobin, Hb）基氧载体（Hb-based oxygen carriers, HBOCs）的研究，但传统设计仍易受氧化损伤，且缺乏红细胞的氧化还原调控机制。与此同时，具有酶模拟催化活性的纳米材料——纳米酶（nanozymes），已成为氧化还原医学中的重要工具。将纳米酶与HBOCs结合，形成了一类具有自我保护能力、多功能性和刺激响应性的氧疗制剂。本综述系统总结了纳米酶整合型HBOCs及Hb衍生纳米酶的研究基础与生物医学潜力。研究人员阐述了金属、碳及金属有机框架（metal–organic framework, MOF）类纳米酶如何模拟超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）及过氧化物酶（peroxidase, POD）等关键抗氧化功能；将此类纳米酶嵌入HBOCs可赋予其内在的氧化保护能力，以及碳酸酐酶（carbonic anhydrase, CA）样催化等附加功能，将被动氧载体转化为智能血液代用品。研究人员进一步重点介绍了其在输血以外的应用场景：在伤口愈合中，光热纳米酶–HBOC杂化体系可实现光控释氧与抗菌作用；在肿瘤治疗中，催化型HBOCs可缓解肿瘤缺氧并增强放疗（radiotherapy, RT）、光热治疗（photothermal therapy, PTT）及光动力治疗（photodynamic therapy, PDT）疗效。最后，研究人员讨论了Hb衍生及红细胞模板化纳米酶在生物传感、辐射防护及感染控制中的应用。
1 引言
氧作为细胞呼吸的终端电子受体，对需氧生命至关重要，但其不完全还原会产生超氧阴离子自由基（O2•?）与过氧化氢（H2O2）等活性氧，可造成脂质、蛋白质及DNA损伤。人体内红细胞通过血红蛋白及胞内抗氧化酶网络，维持氧输送与氧化还原调控之间的精细平衡，这一特性启发了数十年来对Hb基氧载体的研究——这类合成系统旨在供血源不可用或禁忌时实现氧输送。除输血医学外，Hb独特的氧结合特性与纳米酶化学的最新进展，已将HBOCs的应用拓展至伤口愈合、肿瘤治疗乃至以Hb本身为前体制备催化材料的更广泛生物医学领域。
纳米酶作为模拟天然酶催化活性的无机或杂化纳米材料，可表现出SOD、CAT或POD样行为，能以与天然酶相当的效率分解O2•?与H2O2，同时具备优异的稳定性。与天然酶不同，纳米酶可在严苛条件下工作，抵抗变性，并以催化而非计量方式发挥作用，为对抗氧化应激提供持续保护。Hb基氧输送与纳米酶基ROS调控的交叉融合，为解决“如何在氧源性自由基存在下安全输氧”这一医学长期挑战提供了仿生方案。
将纳米酶整合入HBOCs，使设计理念从结构仿生转向功能仿生。这类杂化结构不再仅稳定Hb，而是通过耦合氧结合与ROS催化解毒，主动模拟红细胞生理。铂（Pt）、铈氧化物（CeO2）及金（Au）基纳米酶已证实兼具双重功能：维持Hb的铁（Fe2+）态并防止氧化降解。除抗氧化外，许多纳米酶还具有光热或氧化还原开关特性，可对氧释放或催化活性进行外部调控，实现了早期HBOC设计无法达到的时空精准性。其生物医学意义深远：在血液替代中，纳米酶整合型HBOCs可作为具有延长保质期与内置抗氧化保护的稳定氧储库；在伤口愈合中，可作为局部“氧仓库”，在恢复缺血组织常氧状态的同时，通过可控ROS生成或清除调控炎症与感染；在肿瘤治疗中，可重新氧合缺氧肿瘤以增强RT或PDT敏感性，同时催化产生细胞毒性ROS以实现协同肿瘤清除。在各类应用中，纳米酶赋予HBOCs催化鲁棒性与多功能性，使其成为智能氧疗制剂而非被动载体。
另一互补研究方向为Hb相关纳米酶：Hb或红细胞组分不再作为氧载体，而是作为催化纳米材料的前体或模板。在热或化学转化过程中，Hb的Fe-血红素中心与氨基酸残基作为内源性掺杂剂，可形成具有显著POD样活性与良好生物相容性的Fe基碳质纳米酶。这类Hb衍生催化剂将负责氧转运的分子转化为催化氧化还原反应的材料本身，衔接了可持续纳米制造与生物医学功能。
综上，这些进展凸显了纳米技术、催化科学与仿生材料设计交叉领域的快速发展。通过将Hb的氧处理精密性与纳米酶的催化稳健性相结合，研究人员正在构建能够在同一平台内输送、感知并调控氧与ROS的多功能材料，这类材料不仅在紧急输血或缺血救援中具有潜力，还可应用于慢性病管理、组织再生与精准肿瘤学。
2 纳米酶：历史根源、机制见解与设计策略
2.1 定义与历史背景
纳米酶的概念植根于19世纪催化与生物催化的基础：1835年将催化定义为物质加速反应而自身不变的过程，“酶”一词则于1877年由希腊语“ενζυμον”（意为“在酵母中”）衍生而来，源于早期发酵研究。20世纪中叶前，生物催化以天然酶为主，同期也有人工酶模拟物的开发，包括环糊精、冠醚、多肽、胶束与分子印迹聚合物，以及通过对蛋白质化学修饰获得的半合成酶，和以核酸为基础的DNA酶与抗体酶。尽管取得进展，多数人工酶的催化活性仍低于天然酶。
纳米酶概念的出现源于认识到纳米尺度物质本身具有催化活性。2004年，Pasquato与Scrimin首次使用“nanozyme”一词命名三氮杂环壬烷功能化金纳米颗粒（Au nanoparticles, AuNPs），其可催化转磷酸化反应。此后该词也曾用于描述Ga3+超分子催化剂（催化缩醛/酮水解）及包裹CAT的阳离子嵌段共聚物——这类体系现被视为纳米固定化催化剂，而非本质活性的纳米酶。2007年是里程碑式节点：研究发现四氧化三铁（Fe3O4）纳米颗粒在H2O2存在下可本质性地氧化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB）、3,3′-二氨基联苯胺与邻苯二胺（1,2-diaminobenzidine, OPD）等过氧化物酶底物，表现出辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）样活性。此后该领域快速扩展，催生了“纳米酶学”术语，全球已有超过200个研究团队从事相关研究。
2021年的定义正式将纳米酶界定为：在生理相关条件下，以酶动力学（如米氏方程Michaelis–Menten）将酶底物转化为产物的纳米材料，即使其分子机制与天然酶不同。为提高命名准确性，“类酶”描述与酶具有相同底物/产物的纳米酶，“仿酶”指尝试复现酶活性位点的结构与功能基序但未完全复制催化机制的体系。重要的是，纳米酶增加了纳米结构限域活性位点、可调尺寸/形貌及独特纳米理化性质（如超顺磁性、光热效应），将生物催化拓展至生物医学、环境管理与农业领域。
2.2 纳米酶的机制原理、设计与工程
纳米酶是催化活性源于表面限域与结构依赖效应的纳米尺度催化材料。其高比表面积、异质性活性位点与纳米限域电子结构促进底物吸附与活化，实现与天然酶类似的反应。重要的是，其周转是纳米结构本身的固有属性，并非源于浸出金属离子或附加分子催化剂。但并非所有纳米酶介导的ROS清除都反映真实的催化循环：部分体系（如Pt、Au与CeO2基纳米酶）通过可逆表面氧化还原转变实现持续周转，而其他体系则随pH与底物流量发生部分或完全氧化还原消耗。例如二氧化锰（MnO2）在中性和酸性环境下催化行为不同，需区分催化性ROS调控与牺牲性氧化还原缓冲。此外，纳米酶活性的生物学后果取决于具体反应路径：是消除ROS（如O2•?歧化或H2O2分解），还是通过POD样过程促进ROS生成。表1总结了纳米酶的主要类酶催化活性，按底物、代表性反应、产物与生物学角色分类，突出抗氧化途径（SOD样与CAT样）与促ROS途径（POD样）的功能差异，并指出催化行为常依赖组成、氧化态与环境参数（如pH）。
催化反应主要发生在特定表面界面（如晶面、不饱和配位位点、异质结边界或缺陷区域），局域几何与电子密度调控反应物活化。由于单个纳米颗粒内共存多种活性位点，同一纳米酶可介导多个并发反应，例如以POD样方式将H2O2分解为羟基自由基（•OH），或以CAT样方式将其转化为分子氧。这种结构多样性是其广泛功能的基础，但也导致反应特异性降低。与天然酶的高底物保真度不同，纳米酶具有底物混杂性，这有利于级联催化与协同反应，却增加了单一路径精准控制的难度。
为驾驭与优化这类催化行为，研究人员设计了多种纳米材料框架以表现类酶活性。数千种无机与有机纳米结构（从块体纳米颗粒到单原子催化剂single-atom catalysts, SAzymes）已被证实具有此类性质，主导材料分为四类：金属基、碳基、MOF基与单原子催化剂体系。其中金属基纳米酶研究最为广泛，包括Fe基家族（Fe氧化物、硫族化物、磷酸盐与普鲁士蓝类似物）与非Fe体系（贵金属Au、Ag、Pt、Ir及过渡金属氧化物/硫化物Cu、V、Mn、Ce、Cd）。多金属结构常通过协同与电子耦合效应优于单金属对应物，凸显了对组成、结构与氧化态精确控制的重要性。碳基纳米酶自2010年首次报道以来，涵盖碳纳米管、氧化石墨烯、氮化碳、碳点、富勒烯等，其催化性能可通过杂原子掺杂（N、Fe、Co、Se、Ni）大幅调控，从而构建高效多酶催化剂。MOF基纳米酶提供额外可调性，其高孔隙率、尺寸均一的架构增强底物扩散并实现尺寸选择性催化，模块化特性允许调节生物相容性、生物降解性与功能，特别适用于生物传感、生物催化与治疗应用。在原子尺度，2019年首次报道的单原子催化剂可实现近100%原子利用率，具有明确的催化中心，多数采用金属-氮-碳配位基序，通过调控配位数与几何结构可精确调节周转频率与底物选择性，双原子单原子催化剂进一步通过协同催化效应提升反应性。
除组成外，形貌与电子调控仍是纳米酶设计的核心。即使在固定化学成分下，粒径、形状或价态的变化也可显著影响催化类型与整体活性。现代设计日益强调多酶样与级联行为，目前已描述超过20种酶模拟物（双酶、三酶、四酶与五酶体系），尤其集中于氧化还原酶家族，可建立自我维持的催化循环，持续提升传感与治疗场景下的效率。同时，将光学、电学、磁学、热学与声学性质与催化功能集成，实现了光、电或磁增强催化，以及多模态成像等混合生物医学功能。
尽管取得进展，多数纳米酶仍表现出低于天然酶的周转速率与更广的底物范围。弥合这一差距需要持续在活性位点精准工程、选择性调控与多功能性优化方面努力，以实现兼具酶级效率与纳米级鲁棒性的材料。
3 纳米酶整合型HBOCs迈向先进血液代用品
供血者输血虽可挽救生命且常规开展，但始终面临物流与安全挑战：需严格配型、储存期短且存在感染传播风险。这些限制在急诊、资源有限环境或宗教原因拒绝输血的患者中尤为突出，因此迫切需要一种能够临时替代或增强血液功能的“人工氧桥”。HBOCs是最受关注的血液代用品候选之一，其利用Hb优异的氧结合特性。
HBOCs研究已发展出多种配方策略以封装Hb用作红细胞代用品，传统设计包括Hb化学交联或聚合、表面聚乙二醇化（PEGylation）、脂质体封装（即“Hb囊泡”）、聚合物纳米颗粒、水凝胶与MOFs。这些策略的目标是防止Hb解离为二聚体（可致肾毒性）、延长循环时间并避免透过血管壁外渗。封装方法通过在Hb周围建立物理屏障，可减少一氧化氮（nitric oxide, NO）清除——NO作为重要血管舒张剂，其清除会导致危险血管收缩与高血压；同时屏蔽Hb免受快速降解，并通过增大尺寸与赋予负电荷外壳（类似白蛋白或细胞膜）帮助HBOCs保留在血管内。
尽管这些工程方案解决了部分HBOC问题，氧化应激仍是主要挑战。脱离红细胞保护环境的Hb易发生自氧化（Fe2+转为Fe3+），形成无法携氧的高铁血红蛋白（methemoglobin, metHb）。自氧化过程产生O2•?，进而歧化为H2O2，这些ROS会进一步氧化Hb并损伤组织。天然红细胞拥有精妙的酶抗氧化系统（包括SOD与CAT）可快速中和O2•?与H2O2，保护Hb与周围组织。相比之下，多数HBOCs缺乏内在抗氧化机制，因而遭受更快的氧化退化与相关副作用。早期解决方案尝试将天然抗氧化酶直接偶联至HBOCs，例如将聚合Hb与SOD和CAT偶联可降低Hb自氧化速率，构建Hb-SOD融合蛋白可抑制metHb形成，或将非血红素Fe酶（如红氧还蛋白）掺入Hb形成兼具携氧与抗氧化活性的Hb-酶共聚物。这些酶基HBOCs证实了同步氧输送与ROS清除的可行性，但生物酶存在局限性：每种酶仅靶向特定ROS、可能具有免疫原性，且在循环中易变性失活。因此需要更鲁棒、广谱的解决方案来保护HBOCs免受氧化损伤。表2对比了早期酶偶联体系与近期纳米酶整合设计，上半部分总结了掺入天然抗氧化酶的配方，下半部分突出了纳米酶基平台，体现了向更鲁棒多功能结构的演进。
纳米酶成为解决这一问题的重要创新方案。Komatsu团队率先将纳米酶化学引入HBOCs，开发了共价Hb-白蛋白簇：中央Hb分子由三个人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）分子屏蔽（Hb-(HSA)3），这种设计利用白蛋白的大尺寸与负电荷改善胶体稳定性，限制Hb从血管渗漏。随后将PtNPs掺入白蛋白外围，获得具有内置抗氧化酶模拟物的HBOC。超小柠檬酸还原PtNPs（约1.8 nm）嵌入蛋白基质，结构分析表明其通过静电作用容纳于HSA的正电荷裂隙中。所得HSA-PtNP复合物表现出强SOD与CAT样活性，其O2•?歧化与H2O2分解效率可与或超过天然或合成酶模拟物。将该纳米酶整合入Hb-(HSA)3簇得到Hb-(HSA(PtNP))3杂化物，其中Hb核心实现氧输送，而PtNP功能化HSA外壳催化清除O2•?与H2O2。该结构显著提升了氧化稳定性：在20 μM H2O2溶液中孵育180分钟后，仅形成17% metHb，而天然Hb为72%。这项工作提供了令人信服的概念验证：直接将纳米酶掺入HBOCs可缓解该领域的主要障碍——Hb的氧化降解，使人工氧载体能够在向缺血组织输氧的同时，保护Hb与周围组织免受再灌注诱导的氧化损伤。
继PtNPs-HSA簇成功后，其他纳米酶也被探索用于整合入HBOCs。研究人员开发了掺入CeO2纳米酶的Hb基系统。CeO2纳米颗粒利用可逆的Ce3+/Ce4+氧化还原对催化歧化H2O2与O2•?，模拟CAT与SOD活性。合成的CeO2纳米颗粒超小（2.2–2.6 nm）、单分散且带负电荷（ζ电位=-26±7 mV），具有萤石晶体结构。所得HBOC为逐层（layer-by-layer, LbL）自组装纳米载体，由聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly(lactide-co-glycolide), PLGA）核心依次包覆Hb与CeO2纳米颗粒，最外层为聚乙二醇（poly(ethylene glycol), PEG）隐形层。为保护组装过程中Hb结构与功能，蛋白首先包覆聚多巴胺（polydopamine, PDA）层以促进粘附与生物相容性。CeO2纳米颗粒表现出强且持久的SOD与CAT样活性，在4°C下至少保持21天催化性能——远超过天然CAT的稳定性。当整合入载Hb的LbL纳米载体后，CeO2纳米颗粒在多轮ROS暴露循环中保留催化性能，证实其以催化而非消耗方式起作用。PEG化进一步增强隐形特性，将免疫球蛋白G（immunoglobulin G, IgG）吸附从91%降至11%，并将细胞摄取减少最多48%。所得CeO2基HBOCs结合了长效抗氧化保护与低巨噬细胞识别，凸显了其作为稳定、耐ROS氧载体的潜力。
为进一步增强HBOC性能，研究人员将仿生策略与纳米酶设计相结合。尽管PEG化仍是赋予隐形特性的金标准，但抗PEG抗体的日益普遍引发了对单核吞噬系统加速清除的担忧，因此正积极开发替代表面修饰方法，包括红细胞膜包覆。红细胞通过表面蛋白、糖链与力学特性实现超长循环寿命，其中CD47与末端唾液酸在免疫逃逸与寿命调控中起关键作用。基于此原理，研究人员用红细胞膜包覆载Hb与CeO2纳米颗粒的LbL纳米载体，所得杂化物可抵抗蛋白吸附，减少内皮细胞摄取，保留高效氧输送，并在宽温度范围内维持强健的纳米酶活性，同时表现出优异的血液相容性与细胞活力，凸显了纳米酶与仿生表面工程结合的优势。
研究人员还将Au基纳米酶整合入HBOCs。在一项研究中，将AuNPs掺入MOF基纳米载体以提供抗氧化保护并维持Hb功能。MOFs是具有可调孔径与大表面积的高度有序多孔配位网络，适合生物分子封装。选择AuNPs是因为其是生物医学应用中研究最广泛的纳米酶之一，合成简便、成本效益高，并可精确控制形貌特征（如尺寸与形状），直接影响催化性能与生物相容性，且具有多重酶模拟活性（尤其是CAT与SOD样功能）。所得AuNPs@PCN-333纳米载体尺寸均匀（约200 nm，多分散指数<0.2），AuNPs（约3 nm）均匀分布于MOF笼（约6.8 nm）内。催化性能方面，AuNPs@PCN-333纳米载体在第一轮反应中分解约45% H2O2，五轮循环后仍保留约25%活性；O2•?清除效率达60%，重复使用后保留约40%活性，表现出良好的可回收性与稳定性。后续封装牛Hb得到AuNPs@PCN-333-Hb纳米载体，基本保留了Hb二级结构与可逆氧结合能力，紫外-可见光谱证实其氧合/脱氧行为完整，且AuNP掺入使H2O2攻击下的metHb形成较无Au对照组减少约8%。该杂化物同时具有高生物相容性，RAW 264.7与HUVEC细胞活力在125 μg/mL浓度下达100%以上。综上，将Au基纳米酶嵌入MOF宿主Hb载体，可实现结合高效氧输送与可回收抗氧化保护的HBOCs，从而减轻Hb自氧化并增强长期稳定性。
除AuNPs外，研究人员还研究了金纳米簇（Au nanoclusters, AuNCLs）——仅含几个到几十个Au原子的超小聚集体，兼具酶模拟催化活性与固有荧光。因其超小尺寸，AuNCLs通常表现出高于较大纳米颗粒的催化活性，但易因聚集导致胶体稳定性差。为克服这一限制，研究人员首次在血液代用品背景下，以Hb同时作为还原剂与稳定剂指导原位合成AuNCLs，得到蛋白保护的AuNCLs（Hb@AuNCLs）。所得杂化物流体力学直径约4.0 nm，带负ζ电位，环形暗场扫描透射电子显微镜（annular dark field scanning transmission electron microscopy, ADF-STEM）与能量色散X射线（energy-dispersive X-ray, EDX）mapping证实0.5–1.5 nm的Au核均匀分布于Hb基质中。Hb@AuNCLs表现出红色荧光（发射波长λem=654 nm，激发波长λex=494 nm），具备体内追踪潜力。结构分析显示Hb形成AuNCLs后发生部分构象重排，α螺旋含量降低，β折叠贡献增加，与圆二色谱结果一致。尽管发生这些变化，可逆氧结合能力基本保留，表现为重复氧合/脱氧循环中特征索瑞（Soret）带位移。凭借CAT样活性，Hb@AuNCLs可高效清除ROS，快速分解H2O2，多轮反应循环后仍保留约50%催化活性。这种抗氧化活性转化为显著的Hb氧化保护作用：在H2O2攻击下，Hb@AuNCLs的索瑞峰损失极小，较游离Hb减少约39%的metHb形成，保护强度超过AuNP基MOF系统，与Hb-(HSA(PtNP))3簇相当。为解决Hb@AuNCLs尺寸过小带来的潜在体内问题，将其封装入PCN-333 MOF纳米载体，通过ζ电位偏移、粒径增大及SEM、ADF-STEM与EDX mapping显示的Fe、Au、Al均匀分布证实封装成功。这一创造性设计说明，在分子水平将纳米催化剂与Hb整合，可得到不仅是氧载体与ROS海绵，甚至兼具成像能力的诊疗一体化HBOCs。
Shellington等报道了一种早期但具概念前瞻性的策略，通过聚硝基氧修饰PEG化Hb（polynitroxylated PEGylated Hb, PNPH）赋予HBOCs内在抗氧化功能，旨在减轻氧化与NO相关毒性，同时保留氧输送能力。在该体系中，牛Hb共价修饰PEG链与每个Hb四聚体约14个硝基氧自由基。硝基氧是稳定的自由基，具有公认的SOD模拟活性，并通过与血红素铁的氧化还原耦合表现出额外CAT样行为，从而实现ROS的催化解毒。PEG化进一步增大HBOC流体力学尺寸，减少内皮相互作用与NO清除，并赋予良好胶体与oncotic性质。重要的是，在创伤性脑损伤合并失血性低血压小鼠模型中，PNPH可实现小容量复苏，比乳酸林格氏液或Hextend（分别广泛用于创伤与手术容量替代的等渗晶体与胶体液）更有效地恢复平均动脉压，并在伤后7天显著减少海马CA1区神经元变性。这些效应归因于硝基氧修饰Hb的联合氧输送能力与催化ROS清除活性，凸显了将稳定、酶模拟氧化还原基序直接整合入HBOCs的治疗潜力。尽管PNPH依赖共价连接的分子抗氧化剂而非无机纳米材料，但该工作预示了现代纳米酶整合型HBOCs的许多核心原则：利用鲁棒、催化性、非生物模拟物重现红细胞抗氧化防御，以提升氧化应激下的安全性与功能表现。
除氧输送外，天然红细胞通过碳酸酐酶介导的二氧化碳（carbon dioxide, CO2）水合为碳酸氢根（HCO3?），在维持全身酸碱稳态中发挥关键作用。这一反应可实现气体交换过程中的CO2清除与血液pH缓冲。然而几乎所有已报道的HBOCs都仅关注氧输送，忽视了这一同等重要的功能。将CA样活性整合入HBOC系统，将是重现天然红细胞完整气体交换功能的重要一步，尤其在酸中毒或通气不足条件下。在此背景下，Pablo-Sainz-Ezquerra等近期报道了Hb封装的沸石咪唑酯骨架（zeolitic imidazolate framework, ZIF）-8纳米颗粒（Hb@ZIF-8 NPs），在单一纳米平台中结合氧输送与CA模拟活性。ZIF-8的Zn2+中心由咪唑配体四面体配位，模拟天然CA的催化基序（Zn2+离子由三个组氨酸残基与一个水分子配位），可实现CO2的可逆水合，同时稳定封装的Hb。所得Hb@ZIF-8 NPs在对硝基苯乙酸水解中表现出显著的米氏行为（R2>0.99），证实真正的类酶催化。
