《RSC Advances》：The protein corona at the nano-bio interface: the need for standardized methodology and opportunities for neurodegenerative disease intervention
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纳米颗粒（Nanoparticle, NP）的“生物身份”不仅由其表面性质决定，更由其在进入生物系统时形成的复杂蛋白冠（Protein Corona, PC）所定义。尽管纳米颗粒设计在克服各类屏障方面已取得显著进展，蛋白冠仍是纳米技术领域的主要挑战。当前蛋白冠
纳米颗粒（Nanoparticle, NP）的“生物身份”不仅由其表面性质决定，更由其在进入生物系统时形成的复杂蛋白冠（Protein Corona, PC）所定义。尽管纳米颗粒设计在克服各类屏障方面已取得显著进展，蛋白冠仍是纳米技术领域的主要挑战。当前蛋白冠研究虽采用了多种分析技术和广泛的实验条件，但迫切需要标准化、高分辨率的方法来实现对蛋白冠最准确、全面的表征。提升技术透明度与可重复性将有助于建立更具预测性的纳米药物研发框架。本综述首先阐述了纳米颗粒的物理化学性质及生物环境如何影响蛋白冠的形成。其次，强调了建立标准化表征方法与技术的紧迫性，以增强对蛋白冠形成机制的理解并提高纳米药物研究的可重复性。此外，为探索纳米颗粒在加速或抑制神经退行性疾病病理特征方面的未开发潜力，本综述总结了纳米颗粒如何调控蛋白聚集与纤维形成，并讨论了蛋白冠对淀粉样蛋白纤维化过程的影响。
引言
纳米颗粒（Nanoparticle, NP）指尺寸在1至数十纳米范围内的材料，涵盖有机、无机及其复合材料，因其尺寸与生物大分子相当、稳定性高且全身毒性低，在药物递送等领域具有广阔前景。纳米系统可通过精确调控形状、尺寸、电荷、疏水性及表面特性实现特定功能，纳米疗法有望提供更精准的药物递送、改善溶解度、防止药物降解、增强疗效并降低免疫反应。然而，纳米药物的临床转化仍受限，核心瓶颈在于蛋白冠的形成。在富含蛋白的生物流体中，纳米颗粒表面会迅速吸附一层蛋白，形成赋予其“新生物身份”的蛋白冠，该身份决定了细胞摄取、生物分布、药代动力学、细胞相互作用及毒性等关键生物学响应。现有研究表明，蛋白冠介导了纳米材料在纤维化过程中的作用，因此成为纳米颗粒靶向递送应用的主要障碍。当前蛋白冠表征缺乏统一标准，导致研究结果可重复性不足。本综述系统梳理了纳米颗粒理化性质与生物环境对蛋白冠形成的影响，提出了标准化表征的迫切需求，并深入探讨了蛋白冠在神经退行性疾病中介导淀粉样蛋白聚集与纤维化的双重角色，最后总结了蛋白冠与淀粉样蛋白竞争纳米颗粒表面的四种机制模型：动力学捕获、生物分子屏蔽、空间位阻（或排斥）及单体隔离。
蛋白冠的形成、组成及其动态交换
蛋白冠是纳米颗粒表面形成的生物分子壳层，根据蛋白结合力可分为紧密结合的内层“硬冠（Hard Corona）”与弱结合、快速交换的外层“软冠（Soft Corona）”。蛋白冠的形成会改变纳米颗粒的尺寸、zeta电位、聚集状态及表面官能团，进而影响其血液循环、靶部位蓄积穿透、细胞摄取及与免疫细胞受体的相互作用。此外，蛋白冠可能导致吸附蛋白的二级结构改变，使其丧失原有生物活性。蛋白冠-纳米颗粒的相互作用高度复杂，受生物环境的动态性及纳米颗粒理化性质共同调控。体外与体内研究证实，纳米颗粒尺寸、表面电荷、表面手性、曲率，以及生物流体的性质、流体动力学特征、温度、暴露时间及制备工艺均会影响蛋白冠的形成。注射后的纳米颗粒流经血管网络时，血管分支与直径等结构特征也会改变蛋白冠的组成。
纳米颗粒性质对蛋白冠形成的影响
优化纳米颗粒特性可实现其功能定制，深入理解尺寸、形状及表面化学如何调控蛋白冠的形成与组成至关重要。
纳米颗粒类型（组成）
纳米颗粒可按来源、尺寸及化学性质分为金属氧化物、金属基、聚合物基、脂质基、碳基、肽或蛋白基及有机纳米颗粒等类别，其中金属氧化物与金属基纳米颗粒在蛋白冠研究中占比近30%。
纳米颗粒尺寸
尺寸是决定蛋白冠形成动力学及靶组织递送的核心参数。通常将1-30 nm定义为小尺寸纳米颗粒，30-70 nm为中尺寸，70-100 nm为大尺寸。尺寸通过表面体积比决定蛋白冠特征与硬化动力学，调控蛋白吸附量；同时影响蛋白吸附的热力学（焓变与熵变），进而控制吸附效应；还决定冠的形态及吸附蛋白的构象。小尺寸纳米颗粒通常与蛋白的结合亲和力较弱，大尺寸颗粒则因更大的界面面积表现出更强的相互作用。此外，尺寸直接影响纳米颗粒的胞外渗及细胞摄取机制：小于70 nm的颗粒更易穿过毛细血管壁，50 nm颗粒主要通过小窝蛋白介导的内吞作用进入细胞，而70 nm颗粒则主要依赖网格蛋白介导的内吞途径。
纳米颗粒形状
现代合成技术可制备球形、棒状、片状、管状、菱形、星形、立方体等多种形状的纳米颗粒。形状显著影响蛋白冠的架构，进而改变纳米颗粒的生物特性与分布。例如金纳米颗粒的形貌会显著影响其纤维蛋白原与胰蛋白酶的吸附行为及聚集特性，免疫球蛋白与白蛋白的吸附也与纳米颗粒形状密切相关。
表面电荷
表面电荷调控蛋白冠组成、纳米颗粒-蛋白冠结合亲和力及蛋白结构变化，最终影响纳米颗粒在生物系统中的功能。带正电的纳米颗粒无论材料类型如何，均比负电表面吸附更多蛋白；但增加负电荷密度同样可提升蛋白吸附质量。阴离子或中性表面上的吸附蛋白通常保持其折叠结构，而阳离子表面则易导致蛋白展开，且该现象在大尺寸、低曲率颗粒中更为显著。
疏水性
高疏水性纳米颗粒比亲水性颗粒吸附更多蛋白，疏水性是决定蛋白在纳米颗粒表面吸附及循环时间的关键因素。例如疏水性纳米凝胶的流体力学直径显著增加，表明蛋白吸附增强；疏水性核黄素包被的超顺磁性氧化铁纳米颗粒也比裸颗粒吸附更多血清蛋白。通过在表面包被两性离子、聚乙二醇（PEG）或碳水化合物基团可制备超亲水性“隐形（Stealth）”纳米颗粒，抑制蛋白吸附并逃避免疫系统清除。
表面手性
纳米颗粒的手性表面与生物活性分子的相互作用决定其表面能，进而影响生物分布与细胞摄取效率。手性表面调控蛋白冠的取向与构象，介导与特定蛋白的相互作用。例如手性金纳米颗粒在体内表现出不同的细胞摄取与组织蓄积，蛋白冠组成（包括脂蛋白、补体及急性期蛋白）存在显著差异；手性分子也决定内化量，聚-L-赖氨酸包被的周期介孔有机硅比聚-D-赖氨酸包被的更易被细胞摄取。近期研究还提出了一种不依赖巯基的配体工程策略，可在血液与细胞内环境中精确调控蛋白冠的形成。
生物环境对蛋白冠形成的影响
蛋白-纳米颗粒及相邻蛋白间的相互作用共同决定蛋白吸附行为与构象变化，细胞内的拥挤环境最终决定纳米颗粒的去向。生物流体类型、孵育环境等因素均会影响蛋白冠的形成与鉴定。
温度
蛋白冠形成的温度会影响其组成（蛋白种类与数量）及硬冠中蛋白的结合亲和力。温度变化可通过改变蛋白构象（如部分或完全展开暴露新的疏水区域）来增加或减少蛋白吸附。例如生理温度（37°C）下纳米颗粒富集载脂蛋白A1与载脂蛋白E，而25°C则更有利于载脂蛋白J（簇集素）的吸附。温度还通过调控内吞过程影响细胞摄取，低温（4°C）与生理温度下的蛋白冠组成存在显著差异，且低温可降低癌细胞与内皮细胞对纳米颗粒的摄取。
pH
疾病与正常微环境的pH存在显著差异，因此评估不同pH条件下的冠形成至关重要。pH可影响纳米颗粒表面蛋白的构象与电荷，进而改变其相互作用。例如牛血清白蛋白在pH 7.4的金纳米颗粒表面吸附较少且二级结构不变，而在pH 4.0时则发生聚集与二级结构改变。人血清白蛋白作为蛋白冠的主要成分，其结构与功能具有pH依赖性，在不同pH的聚乙二醇（PEG）、糖基化金纳米颗粒表面表现出不同的冠形成程度。此外，pH与离子强度共同决定纳米颗粒与蛋白冠的相互作用强度，酸性条件下静电作用增强，会提升吸附系数并促进聚集。
生物流体来源及相关因素
蛋白冠形成是动态过程，蛋白浓度与相互作用时间控制吸附，而解吸附则取决于蛋白-纳米材料复合物的结合能。体内与离体研究证实，样本来源、血浆浓度、孵育时间、动物性别均会影响不同纳米系统的蛋白冠组成。体外与体内形成的蛋白冠存在显著差异，血管结构与流体动力学会导致体内冠在蛋白种类与数量上与体外结果不同，流体剪切力还可能剥离纳米颗粒表面松散结合的蛋白冠。此外，孵育时间也是重要影响因素，不同时间点可解析蛋白组成的演化过程。值得注意的是，人血浆中Aβ1–42与Aβ1–40样本的蛋白冠分别含有58种与31种独特蛋白，这些蛋白均参与补体激活、炎症及蛋白代谢通路，与阿尔茨海默病病理密切相关。
纳米颗粒理化性质对神经退行性疾病干预的意义
纳米颗粒表面可作为异相催化剂诱导淀粉样蛋白的构象转换，表面电荷可促进淀粉样肽的早期聚集并加速寡聚体形成。例如带正电的TiO2–NH2纳米颗粒更易吸附Aβ42肽，增强其寡聚体聚集能力。针对α-突触核蛋白，正负电荷纳米颗粒均被证明可抑制或加速其纤维化。工程化方法（如纳米抗体、纳米酶及先进纳米颗粒）为神经退行性疾病的诊疗提供了精准手段：聚合物纳米颗粒的形状设计可用于治疗神经炎症，无机纳米颗粒的表面修饰可作为神经疾病的疗法及阿尔茨海默病的诊断工具。然而，当前纳米颗粒在阿尔茨海默病与帕金森病中的研究多为短期实验，无法反映慢性暴露的长期效应，且普遍忽略了蛋白冠对淀粉样蛋白纤维发生的影响。纳米颗粒理化性质的变异性（表面化学、电荷、尺寸分布、聚集态、疏水性、亲水性及蛋白冠形成）导致研究结果异质性高，可重复性差，加之血脑屏障穿透效率低、稳定性不足及脱靶效应等安全问题，严重阻碍了临床转化。
蛋白冠制备与表征的研究方法学
纳米技术领域需全面理解纳米颗粒与生物系统的相互作用，以设计安全高效的临床诊断与治疗应用。尽管已发表大量研究并采用多种分析技术与实验条件，但目前仍缺乏标准化的蛋白冠表征方案，非标准方法可能导致结果误读，严重挑战了纳米医学的可重复性与可靠性。因此，针对每种纳米制剂，亟需建立标准的分析方法与技术，以稳健精确地研究纳米颗粒、生物系统及纳米颗粒-蛋白冠相互作用界面的参数。
蛋白冠的制备（制备、洗涤介质与分离等）
生物流体质量、制备与储存条件（抗凝剂选择、长期储存温度、样本处理历史）均会显著影响蛋白冠组成。蛋白冠研究可在纯蛋白溶液、复杂蛋白溶液（血清、细胞裂解液）及活细胞中进行，但体内冠形成更复杂且动态变化，会持续从局部环境获取组织或细胞特异性蛋白。因此，需对生物流体（人源血清/血浆、牛源材料等）进行严格质量控制，并考虑样本来源、储存介质、性别、年龄等因素。洗涤步骤的数量与介质也会影响硬冠组成、蛋白稳定性及细胞摄取，通常建议至少洗涤3次以有效去除未结合蛋白。离心是最常用的标准分离方法，但专家建议采用更温和的分离手段结合定量蛋白质组学分析，以实现对各类冠的定性表征。新兴的磁分离与多步离心法相比传统方法具有更好的可重复性。此外，高效液相色谱-电喷雾电离-轨道阱质谱（HPLC/ESI-Orbitrap）、X射线光电子能谱等技术可有效鉴别稳定吸附的冠与弱吸附冠，而基于高性能液相色谱-串联质谱的双过滤策略可识别特定的细胞内冠蛋白。磁悬浮技术是分离冠包被纳米颗粒的有效工具，而纳米液相色谱-质谱（nano-LC-MS）则是表征冠组成的金标准。但传统方法常面临共分离内源性杂质（如细胞外囊泡）的挑战，会导致蛋白质组学分析结果出现假阳性，去除内源性细胞外囊泡可使聚苯乙烯纳米颗粒上的鉴定蛋白减少60-75%，凸显了纯化步骤的重要性。
蛋白冠-纳米颗粒复合物表征的常见与新兴技术
理解蛋白冠的分子组成与动力学对调控纳米颗粒的细胞相互作用至关重要。经典的原位表征方法包括动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）、荧光相关光谱（FCS）、圆二色光谱（CD）及等温滴定量热法（ITC），可提供纳米颗粒-蛋白复合物的尺寸、形态、相互作用计量学与结合动力学及蛋白构象转变的关键信息。新兴技术如小角X射线散射（SAXS）适用于原位冠分析，可解析高浓度样品中的纳米-生物界面相互作用；光催化邻近标记技术（nano-PPL）能以5秒精度实时捕获软冠；毛细管等电聚焦-串联质谱（cIEF-MS/MS）可保留蛋白亚型与翻译后修饰信息，助力生物标志物发现；原子力显微镜（AFM）可可视化吸附蛋白的结构变化与取向；差示离心沉降（DCS）则适用于表征异质样品中的多层冠结构。核磁共振（NMR）光谱可在无需破坏性分离的情况下，于天然液态环境中研究蛋白冠-纳米颗粒的相互作用，分子动力学模拟则可作为互补工具，在原子层面深入表征蛋白冠形成过程及纳米颗粒理化性质的调控作用。
新兴进展、当前差距及蛋白冠方法学标准化的策略
传统自下而上蛋白质组学（BUP）无法区分蛋白亚型，导致翻译后修饰数据丢失，难以预测纳米颗粒的具体生物学相互作用。与之相对，自上而下蛋白质组学（TDP）可直接分析完整蛋白，提供更准确的活性冠图谱。二者的整合已成功识别出3505种蛋白亚型，较以往研究提升4倍，是目前报道的最大蛋白冠数据集。此外，原位与高通量技术的发展可捕获传统离心法易丢失的软冠，微流控平台能精确控制微环境（几何结构、pH、温度），缩小体外与临床研究间的差距。机器学习模型也可用于预测蛋白冠组成及生物学影响，例如定量结构-性质关系（nano-QSPR）模型可关联纳米颗粒涂层与蛋白冠指纹，预测其表面电荷。然而，目前仍存在临床转化与工业可扩展性的重大缺口，缺乏对年龄、性别、疾病状态（如神经退行性疾病、糖尿病或炎症）如何改变蛋白冠的患者特异性数据。此外，体内蛋白冠分析的瓶颈尚未突破，且缺乏蛋白冠报告的记录指南与监管路线图。标准化工作流程可将不同设施间的蛋白鉴定重叠率从11%提升至40%，证明了共识协议的重要性。针对神经退行性疾病研究，还需解决血脑屏障穿透、蛋白错误折叠与毒性等特殊挑战，需开发动态方法追踪蛋白冠在系统运输中的演化，并考虑病理状态对冠组成的影响。
应对蛋白冠形成挑战的可能策略
生物流体的收集与储存是首要关键步骤，样本来源、预处理条件（裂解条件、孵育与血清/血浆处理）及洗涤介质均会影响蛋白冠组成与细胞摄取。此外，表征技术的选择与理化性质、胶体稳定性的评估准确性也直接决定结果的可靠性。
蛋白排斥包被与预包被策略
通过抗污聚合物（如聚乙二醇化，PEGylation）或两性离子表面修饰可减少蛋白冠形成，延长循环时间并降低免疫原性。但PEG的非降解性可能导致重复给药后产生抗PEG抗体，加速纳米颗粒清除。预包被特定蛋白（如亲和体、壳聚糖）可招募有利于靶向的蛋白，提升纳米颗粒的靶向效率与药物递送能力。
与蛋白冠偶联策略
利用蛋白与纳米颗粒表面的特异性结合（如亲水性纳米颗粒易结合触珠蛋白，疏水性纳米颗粒易结合玻连蛋白），可设计具有诊疗潜力的纳米系统。例如牛血清白蛋白（BSA）可作为外部稳定剂，也可通过包被壳聚糖核心实现疏水性药物的缓释与胃稳定性提升。
蛋白修饰策略
修饰蛋白（如人血清白蛋白HSA）可减少蛋白冠的再吸附，降低其对靶向性的不利影响。例如叶酸与荧光素异硫氰酸酯修饰的HSA壳层可显著减少纳米颗粒从血清中重新吸附蛋白冠，而将配体偶联到平衡后的纳米颗粒-冠复合物上，比直接偶联到裸纳米颗粒表面更能增强配体靶向功能。
蛋白冠的细胞摄取、转运与免疫反应
纳米颗粒进入细胞内部是实现药物胞内递送的关键步骤，而蛋白冠会以正负双向方式影响纳米颗粒的血液流通、靶部位蓄积与穿透，最终决定其细胞摄取、生物分布、药代动力学、细胞相互作用及毒性。细胞摄取主要通过网格蛋白介导的内吞、小窝蛋白介导的内吞、巨胞饮等途径完成，具体途径由纳米颗粒的理化性质、生物微环境与吸附的蛋白冠共同决定。例如15 nm、45 nm球形及棒状金纳米颗粒主要通过受体介导的内吞进入细胞，星形颗粒同时采用网格蛋白与小窝蛋白介导途径，而80 nm颗粒则依赖巨胞饮。蛋白冠的存在可能屏蔽靶向基团，导致主动靶向失效，甚至破坏细胞代谢通路引发细胞死亡。此外，蛋白冠中的补体、免疫球蛋白与载脂蛋白可触发免疫反应，促进免疫细胞清除纳米颗粒，缩短其系统半衰期，影响递送能力与安全性。因此，精准调控纳米颗粒蛋白冠与免疫细胞的相互作用是开发药物递送纳米平台的核心。
蛋白冠-淀粉样蛋白相互作用与神经退行性疾病
淀粉样蛋白（如Aβ、tau、α-突触核蛋白）的聚集与纤维化是阿尔茨海默病等神经退行性疾病的主要病理途径。纳米颗粒因可控的尺寸与表面化学，可提供多个结合位点与强结合能力，在跨越生理屏障递送的同时调控纤维化动力学，比单一结合位点的小分子抑制剂更具优势。纳米颗粒表面作为异相催化剂，可诱导淀粉样蛋白的构象转换：既可通过浓缩蛋白、降低成核能垒发挥促纤维化作用，也可通过隔离单体、空间位阻阻止新单体加入发挥抗纤维化作用。淀粉样蛋白纤维化遵循成核、延伸、饱和的三阶段动力学模型：纳米颗粒可降低初级成核的能量势垒，也可在延伸阶段作为竞争性抑制剂隔离单体，或在次级成核阶段通过空间位阻阻断现有纤维上的成核位点。蛋白冠的两亲性（由载脂蛋白等脂质与蛋白组成）可调节局部肽浓度与Aβ的构象变化，其静电作用可调控tau蛋白与硬冠中阴离子蛋白的相互作用，决定其生理功能或病理聚集。
纳米颗粒的抗纤维化效应
纳米颗粒的理化性质（尺寸、电荷、形状/形貌）决定其抑制或促进纤维化的能力。例如表面修饰不同的金纳米颗粒，其抑制能力与聚集体的形态均由尺寸与表面化学决定；三角形银纳米片比球形银纳米颗粒更有效溶解纤维；氧化锌纳米花因尖锐边缘表现出最高的淀粉样蛋白降解速率。表面修饰可进一步提升抗纤维化效能，如靶向肽偶联硒纳米颗粒通过协同效应阻断纤维形成的活性位点；酪氨酸或色氨酸残基功能化的金银纳米颗粒可抑制胰岛素的自发与种子诱导聚集，并触发纤维解体。此外，近红外光响应纳米颗粒可穿透血脑屏障，强效结合Aβ1–42并抑制其纤维化，同时改善小胶质细胞的免疫功能以促进Aβ清除。
纳米颗粒的促纤维化效应
纳米颗粒对纤维化的影响具有双重性，部分研究显示其可促进聚集。例如无正电荷的聚（丙烯亚胺）树状大分子与聚对苯二甲酸乙二醇酯纳米颗粒会加速淀粉样纤维形成；TiO2纳米颗粒通过疏水作用稳定Aβ42肽的结合位点，缩短成核阶段；MoS2纳米片可通过范德华力吸引人胰岛淀粉样肽单体、二聚体与寡聚体至其表面，促进聚集。值得注意的是，ZnO纳米颗粒存在下形成的淀粉样蛋白的细胞毒性反而低于纯淀粉样蛋白，提示纤维化产物的毒性并非绝对。
淀粉样蛋白-蛋白冠相互作用及其对寡聚化与纤维化的影响概述
体内给药的纳米颗粒并非以原始状态与Aβ蛋白相互作用，而是被蛋白包被，这种纳米颗粒-蛋白冠复合物可发挥抗纤维化或促纤维化双重作用。蛋白冠可通过四种机制与淀粉样蛋白竞争纳米颗粒表面的吸附位点：空间位阻（非淀粉样蛋白覆盖反应位点，物理阻断单体接触）、单体隔离（作为单体库消耗纤维延伸的前体）、动力学捕获（稳定单体于非β-折叠构象，形成无法加入纤维的旁系寡聚体）、分子伴侣样作用（竞争性抑制淀粉样聚集的关键步骤）。监测冠包被纳米颗粒存在下的淀粉样蛋白纤维化过程，比仅用裸纳米颗粒更能获得可靠可预测的结果。此外，淀粉样纤维本身在体内也会形成蛋白冠，改变其生物身份与毒性，这一发现为缓解淀粉样蛋白毒性提供了新视角。总体而言，蛋白冠通常会降低纳米颗粒的促纤维化效应，但动态性仍导致其效应复杂多变，需将其从生物屏障转化为可编程的活性工具，以推进纳米医学发展。
结论与未来展望
纳米颗粒在临床应用中潜力巨大，有望克服药物递送的各类生物屏障，实现精准治疗。然而，生物分子冠（主要为蛋白）的自发形成决定了纳米材料的命运，因此开发安全高效的纳米诊疗产品必须依赖可靠的蛋白冠表征与标准化方法。当前蛋白冠研究缺乏统一标准，严重制约了结果的可重复性与透明度，亟需建立可广泛复现的稳健表征流程，并结合原位表征技术与蛋白冠工程策略，主动调控与利用其特性。最终，纳米医学的成功临床转化需要监管机构、资助机构与科学界的协同努力，共同推动标准化框架的建立与实施。
