参苓降浊方通过抑制NF-κB/NLRP3通路减轻血管炎症缓解ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化

《Journal of Ethnopharmacology》：Shenling Jiangzhi Formula Alleviates Atherosclerosis in ApoE-/- Mice by Inhibiting Vascular Inflammation via the NF-κB/NLRP3 Pathway

　　

参苓降浊方（SJF）是一种临床常用于治疗动脉粥样硬化（AS）的中药复方，具有益气健脾、补肾化浊、活血通络、清肝解毒的功效。该研究旨在阐明SJF的化学成分及其抗AS的药效物质基础，并探讨其对ApoE^-/-小鼠AS模型斑块形成和炎症反应的调控作用及机制。研究人员采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱串联质谱（UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS/MS）技术分析SJF的化学成分，并归属各成分来源药材；运用网络药理学和分子对接技术筛选SJF抗AS的核心靶点与活性成分；通过高脂饮食联合间歇性水环境（睡眠剥夺）建立ApoE^-/-小鼠AS模型，以瑞舒伐他汀灌胃作为阳性对照；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清血脂指标（总胆固醇TC、甘油三酯TG、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C、高密度脂蛋白胆固醇HDL-C）、炎症细胞因子（高敏C反应蛋白hs-CRP、白细胞介素-1β IL-1β、IL-6、IL-18、核因子-κB NF-κB、单核细胞趋化蛋白-1 MCP-1）及其他相关标志物（血红蛋白Hb、氧化三甲胺TMAO、食欲素A Orexin A）浓度；通过苏木精-伊红（HE）染色和油红O染色观察细胞形态及主动脉斑块面积；采用蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测主动脉中IL-1β、IL-18、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）、半胱天冬酶-1（Caspase-1）、活化型Caspase-1（cleaved Caspase-1，p20）及凋亡相关斑点样蛋白（ASC）的表达水平。研究结果表明，从SJF中鉴定出313种化学成分，包括萜类、黄酮类、蒽醌类等；网络药理学结合分子对接技术筛选发现，SJF治疗AS的活性成分为木犀草素、槲皮素、山柰酚、异鼠李素、β-谷甾醇和花生四烯酸，关键治疗靶点包括IL-1β、基质金属蛋白酶9（MMP9）、IL-6、趋化因子配体8（CXCL8）等。HE染色和油红O染色显示，与模型组相比，给药组主动脉内膜厚度变薄，AS斑块减少。此外，SJF能够降低血脂水平，下调炎症因子表达，增加血红蛋白浓度以改善AS病变的缺氧微环境，从而减轻血管内皮损伤，抑制巨噬细胞泡沫细胞形成及斑块脂质沉积。机制研究表明，SJF可能通过抑制NF-κB/NLRP3信号通路来抑制AS斑块进展，发挥其抗AS效应。结论认为，SJF通过抑制NF-κB/NLRP3信号通路的激活改善AS相关炎症反应，降低异常血脂水平，加速脂质代谢，减少脂质沉积，抑制AS斑块发展，发挥抗AS作用。

动脉粥样硬化（AS）是现代医学病理概念，是多种心血管疾病的主要病理基础，其早期病理特征为血管内皮细胞损伤，继而炎症细胞（主要为单核细胞和巨噬细胞）浸润，随疾病进展逐渐出现脂质沉积，最终形成AS斑块。临床上主要表现为脂质沉积、炎症细胞反应（以巨噬细胞浸润为主），若不及时干预，后期可形成脂肪条纹、纤维斑块和粥样斑块，甚至出现斑块破裂、出血、钙化及粥样溃疡和血栓形成，进而引起血管、心脏和脑部病变。高脂血症是临床上导致AS的主要因素，与脂质沉积形成AS斑块的事实基本吻合。AS的早期表现即为血脂异常，这是AS最重要的危险因素。AS最初被认为是动脉壁脂质代谢异常导致的脂质蓄积，后来认为炎症反应也参与其中，且炎症反应贯穿AS发生发展的全过程。多种炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-1β、IL-6、IL-18和hs-CRP加速AS的发生。在中医理论中，高脂血症归属于"痰浊""湿阻""眩晕"等范畴，其外因是饮食不节、过食肥甘厚味，内因是脾虚，属本虚标实之证，其中脾肾虚为本、瘀浊为标。脾失健运导致水谷精微代谢异常，精脂不能正常转化转输，清阳不升、浊阴不降，从而形成脂代谢紊乱和高脂血症。睡眠对心血管健康至关重要，睡眠不足或紊乱是AS的独立危险因素。近期研究表明，睡眠通过神经-免疫轴调节造血并抵御AS，睡眠片段化减少外侧下丘脑食欲素产生，导致骨髓造血增加和Ly-6C^high单核细胞增多，进而加速AS病变进展。食欲素（orexin）通过限制骨髓前中性粒细胞集落刺激因子1（CSF1）的产生来抑制过度单核细胞输出和血管炎症，维持正常心血管功能。临床AS常伴有睡眠障碍，单因素建模无法完全模拟复杂临床病理特征，因此该研究采用高脂饮食联合睡眠剥夺的双因素模型，以更好地模拟临床状况并提高实验结果的转化价值。

他汀类药物是AS常规药物治疗的主要药物，其中辛伐他汀、阿托伐他汀和瑞舒伐他汀最为常用，但临床证据表明他汀类药物存在疲劳、胃肠不适、肝功能损伤、肾功能损害、肌肉损伤和胰岛素抵抗等不良反应，这些问题促使研究人员寻找既能保证疗效又可减少药物副作用和不良反应的新型替代药物。目前，中药复方在临床实践中已显示出优异的治疗效果。参苓降浊方由人参、绞股蓝、茯苓、何首乌、银杏叶、姜黄、山楂、泽泻、决明子、芦荟和大黄11味中药组成，以健脾、调代谢、化痰湿为组方原则。方中多味关键药材见于古代经典方剂治疗代谢紊乱的记载，如《太平惠民和剂局方》参苓白术散（含人参、茯苓）改善脾虚及代谢功能障碍，《外科正宗》加味卫苓汤（含人参、茯苓、山楂、泽泻）用于改善痰湿内停相关高脂血症，《辨证录》参附甘桔汤（含人参、茯苓、山楂）针对长期高脂饮食所致代谢紊乱，《伤寒论》五苓散（含茯苓、泽泻）促进水液代谢、减少脂质沉积，《太平圣惠方》何首乌丸及《世补斋医书》延寿丹均以何首乌补肝肾、护血管，《本草纲目》及《日用本草》记载山楂、决明子、泽泻配伍有助于降脂减积，《名医别录》及《新修本草》记载虎杖、姜黄、山楂配伍可改善血行、延缓血管硬化。基于中医理论，SJF以整体观念治病求本，其中人参为君药，大补元气、健脾养心；绞股蓝、茯苓、何首乌、银杏叶、姜黄为臣药；山楂、泽泻、决明子、芦荟、大黄为佐使药。研究表明，人参皂苷类成分具有广泛抗炎活性，人参皂苷F1可通过抑制凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）/NF-κB通路减轻内皮损伤、抑制AS，人参皂苷Rg3和韩国黑参可靶向抑制NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）表达，人参皂苷Rb1可改善异常脂质代谢、抑制脂质过氧化，从而阻止AS合并抑郁的进展。绞股蓝皂苷是其抗AS的功能性成分，可能通过抑制前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）/LOX-1信号通路改善内皮功能，绞股蓝皂苷XVII可通过激活miR-182-5p/组蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）信号通路抑制脂质沉积、缓解炎症反应。茯苓多糖可抑制血清炎症介质和脂质水平升高，改善主动脉病理损伤，抑制Toll样受体4（TLR4）/NF-κB通路激活，下调MMP-2和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）蛋白表达。何首乌主要活性成分2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（TSG）可缓解脂质蓄积和炎症反应，调节ApoE^-/-小鼠肠道微生物失衡，预防AS发展，还可通过一氧化氮（NO）/环磷酸鸟苷（cGMP）/蛋白激酶G（PKG）信号通路抑制血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）诱导的血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖，或通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（PGC-1α）信号通路改善高脂诱导的血管衰老和内皮损伤。银杏叶提取物（GbE）可抑制脑内促炎细胞因子IL-1β和TNF-α产生，上调抗炎细胞因子IL-10及其受体IL-10R表达，与西洛他唑联用可显著降低MCP-1、可溶性血管细胞黏附分子-1（sVCAM-1）和VCAM-1表达，减少巨噬细胞向血管内膜浸润；GbE重塑的肠道菌群对AS缓解有重要贡献。姜黄在主动脉和肝脏中表现出抗炎活性且无肝毒性，可缓解高胆固醇饮食兔的氧化应激、减少主动脉脂肪条纹形成，与朝鲜蓟提取物联用可通过调节抗炎、抗氧化和脂质代谢过程发挥协同抗AS、抗高脂血症和抗肝脂肪变性作用。山楂及丹参-山楂药对可通过调节血脂、抑制炎症反应、保护血管内皮功能发挥抗AS效应，山楂叶黄酮可通过抑制分泌型磷脂酶A2-IIA（sPLA2-IIA）/固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白（SCAP）-SREBP2-低密度脂蛋白受体（LDLR）通路、增强抗氧化能力、促进胆固醇逆向转运、抑制泡沫细胞形成，进一步延缓AS进展、缓解斑块病变。泽泻成分泽泻醇A 24-乙酸酯可通过抑制肠道胆固醇吸收发挥抗AS作用，泽泻醇B 23-乙酸酯靶向雌激素受体α，通过抑制PCSK9、上调LDL受体改善脂质代谢，有效预防绝经后AS；苓泽方可降低血清尿酸，通过抑制JAK2/STAT3/NLRP3信号通路减轻血管炎症和内皮损伤。决明子具有强效降脂活性，降脂宁乙醇提取物（含何首乌、山楂、决明子、荷叶）可降低大鼠血浆TC、TG和LDL-C水平，其中蒽醌化合物rubrofusarin-6-β-龙胆二糖苷可通过AMP活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路抑制脂质蓄积以调节高脂血症。芦荟活性成分包括芦荟大黄素和芦荟多糖，芦荟大黄素可通过抑制肝脏PCSK9/LDLR通路降低高脂血症大鼠胆固醇含量，芦荟多糖可通过调节肠道菌群-肝脏代谢轴促进胆汁酸排泄、逆转AS相关微生物改变以发挥抗AS效应。虎杖主要活性成分虎杖苷可靶向抑制血小板黏附于胶原，阻断AS早期血栓形成和斑块进展，同时可降低高脂高胆固醇饮食仓鼠血清TC、TG、LDL-C水平及肝脏TG含量，升高LDL-C/HDL-C和TC/HDL-C比值。前期临床观察表明，参苓降浊片具有良好的降脂效果，显效率和总有效率均优于脂必妥片，动物实验证实其无明显毒副作用，可长期服用巩固疗效。

该研究使用的关键技术方法包括：UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS/MS技术进行化学成分定性分析；网络药理学联合分子对接技术进行核心靶点与活性成分筛选及验证；高脂饮食联合间歇性水环境睡眠剥夺建立ApoE^-/-小鼠AS双因素模型；ELISA检测血清生化指标；HE染色和油红O染色进行组织形态学观察；Western blotting检测蛋白表达水平。

研究结果部分主要包括以下内容：

化学成分鉴定结果：通过UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS/MS技术从SJF乙醇提取物中鉴定出313种化学成分，包括石油醚部位32种、二氯甲烷部位100种、乙酸乙酯部位135种、正丁醇部位46种化合物，涵盖萜类、黄酮类、蒽醌类等成分类型。

网络药理学与分子对接结果：基于上述成分进行网络药理学分析，筛选发现木犀草素、槲皮素、山柰酚、异鼠李素、β-谷甾醇和花生四烯酸为SJF治疗AS的活性成分，IL-1β、MMP9、IL-6、CXCL8等为关键治疗靶点，并通过分子对接技术进行了验证。

主动脉斑块形态学结果：HE染色和油红O染色显示，与模型组相比，SJF给药组主动脉内膜厚度变薄，AS斑块面积减少，表明SJF可抑制AS斑块发展。

血清生化指标结果：SJF可降低ApoE^-/-小鼠血脂水平（TC、TG、LDL-C），下调炎症因子（hs-CRP、IL-1β、IL-6、IL-18、NF-κB、MCP-1）表达，增加血红蛋白浓度以改善AS病变缺氧微环境，升高TMAO和Orexin A水平。

主动脉组织蛋白表达结果：Western blotting检测表明，SJF可下调主动脉组织中IL-1β、IL-18、NF-κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、cleaved Caspase-1（p20）及ASC蛋白的表达水平。

机制研究结果：综合上述结果，SJF通过抑制NF-κB/NLRP3信号通路激活，减轻血管炎症反应，从而发挥抗AS效应。

研究讨论部分总结如下：AS是心血管疾病的病理核心基础，严重威胁人类健康。《中国心血管健康与疾病报告2024》显示，我国AS相关心血管疾病患者数量庞大，包括2634万卒中患者、1100万冠心病患者、4530万外周动脉疾病患者，且相关疾病患病率仍在上升。SJF基于中医"脾虚湿盛、痰瘀互结"的核心病机认识，以健脾化湿、活血通络为治法，其化学成分复杂多样，通过网络药理学和分子对接技术可系统揭示其多成分、多靶点的作用特点。该研究采用的高脂饮食联合睡眠剥夺双因素模型，较单纯高脂饮食模型更好地模拟了临床AS伴睡眠障碍的病理特征，提高了实验的临床转化价值。研究证实SJF在改善血脂异常、抑制炎症反应、减少斑块形成方面具有显著效果，且其机制与抑制NF-κB/NLRP3通路密切相关，这与近年来越来越多的研究认识相一致，即天然药物可通过调控NLRP3炎症小体发挥抗AS作用。SJF中的黄酮类活性成分如槲皮素、山柰酚等已被广泛报道具有抗炎、抗氧化、改善内皮功能等作用，其通过NF-κB/NLRP3通路发挥效应具有物质基础。该研究为SJF的临床应用提供了实验依据，也为中药复方治疗AS的机制研究提供了参考。

研究结论为：基于中医特色，该研究整合网络药理学、分子对接和动物实验，阐明槲皮素、异鼠李素、木犀草素和山柰酚为SJF抗AS的核心药效物质，CCL2、IL-1β和MMP9等10个靶点为关键靶点。其作用机制为改善血脂异常、减少脂质沉积、抑制AS斑块发展，同时下调NF-κB/NLRP3炎症通路相关蛋白表达，抑制先天免疫介导的炎症反应，从而发挥抗AS作用。该论文发表于《Journal of Ethnopharmacology》。