《Journal of Food Composition and Analysis》：Comparison of multiplex real-time PCR, LC-MS and MALDI-TOF MS applications for the species identification of crustaceans
编辑推荐：
随着全球海产品市场的扩张，甲壳类在消费者中的受欢迎程度日益增加。为防止物种误标或食品欺诈，从而保护消费者权益，分析工具对于验证贸易物种的正确分类至关重要。本研究提出了三种分析方法，以满足常规实验室对可靠甲壳类物种鉴定日益增长的需求。共有288份甲壳类样品（涵盖
随着全球海产品市场的扩张，甲壳类在消费者中的受欢迎程度日益增加。为防止物种误标或食品欺诈，从而保护消费者权益，分析工具对于验证贸易物种的正确分类至关重要。本研究提出了三种分析方法，以满足常规实验室对可靠甲壳类物种鉴定日益增长的需求。共有288份甲壳类样品（涵盖68个物种）用于建立和验证多重实时荧光定量聚合酶链式反应（multiplex real-time PCR）、液相色谱-串联质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）方法。为进行方法测试和比较，三个实验室之间组织了一次实验室间比对试验。实时荧光定量聚合酶链式反应方法准确检测了四种目标物种。利用现有的物种特异性肽段标志物（目标多反应监测，targeted multiple reaction monitoring, MRM），LC-MS能够作为独立的鉴定方法以高可靠性鉴定甲壳类物种，且未出现假阳性结果。此外，基于非靶向LC-MS数据的随机森林（random forest）模型被用于支持分析结果并提供额外信息。MALDI-TOF MS鉴定甲壳类的可行性得到了验证，但尚需进一步扩展数据库。本研究为常规实验室提供了在相异仪器配置下保证产品安全控制的适用方法，以满足不断扩大的海产品贸易需求。
本研究发表于《Journal of Food Composition and Analysis》，旨在应对全球海产品贸易扩张背景下的甲壳类物种准确鉴定需求。甲壳类与鱼类、头足类并列为世界范围内营养重要且日益受青睐的海产品，然而由于生产和加工常外包至劳动力成本较低的国家，形态学特征在生产过程中丢失，贸易路线冗长且分支复杂，导致物种身份信息易失，进而产生非故意误标或有意食品欺诈。尽管DNA条形码联合Sanger测序是目前物种鉴定的金标准，但控制实验室仍需根据具体分析问题和设备条件选择适宜的技术途径。基于此，研究人员开发了三种甲壳类物种鉴定方法并开展比较研究。
本研究使用的关键技术方法如下：样本队列来源于2019至2022年间从克罗地亚、德国、印度、摩洛哥、塞舌尔和西班牙六国收集的288份甲壳类样品，涵盖68个物种及8个仅鉴定至属水平的个体，包括参考样品和零售样品，经形态学鉴定和DNA条形码确认物种身份。多重实时荧光定量聚合酶链式反应方面，采用Brenn等人建立的针对斑节对虾（Penaeus monodon）、南美白对虾（P. vannamei）、阿根廷红虾（Pleoticus muelleri）和挪威龙虾（Nephrops norvegicus）的多重体系，使用CFX96 Touch实时荧光定量聚合酶链式反应检测系统进行特异性验证。液相色谱-串联质谱联用方面，采用靶向MRM方法，使用1290 Infinity II液相色谱仪和QTRAP 6500+三重四极杆-线性离子阱复合质谱仪，识别了14种甲壳类的49个物种特异性肽段标志物；同时采用nanoHPLC-LTQ XL平台获取非靶向肽段谱，基于随机森林模型进行机器学习分类，该模型以保留时间（retention time, Rt）、质荷比（mass-to-charge ratio, m/z）和峰信号强度为输入变量进行物种预测。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方面，使用Bruker microflex LT仪器，依据Stahl和Schr?der的方案并优化甲壳类组织处理流程，建立包含21种甲壳类的内部参考数据库（MSP-DB），通过留一法交叉验证进行数据库内部验证，并以54份零售样品进行外部验证。
关于研究结果，本研究分为以下部分进行阐述：
**多重实时荧光定量聚合酶链式反应** 研究人员对31种物种及4个属水平样品进行了扩展特异性测试，验证了该方法的高特异性。大部分非目标物种在四个检测通道中未产生信号。部分印度南美白对虾（P. indicus）样品与南美白对虾（P. vannamei）混装导致Lvan引物探针组出现非有效结果（Cq值约37）；印度斑节对虾（P. monodon）样品因属于变异型A且可能存在DNA片段化，呈现较高Cq值（24.29±1.38）。基于观察结果和检测限（0.2-2 pg DNA/反应），研究人员建议将Cq值<30设为阳性检测阈值。在实验室间比对试验中，三个盲样被正确鉴定：斑节对虾（Cq: 19.78±0.17）、南美白对虾（Cq: 19.48±0.02）和挪威龙虾（Cq: 18.42±0.03），其余非特异性信号均>30，证实了该方法的可靠性。
**液相色谱-串联质谱联用与随机森林模型** 在实验室间比对试验中，四个具有可用肽段标志物的盲样中有三个被正确鉴定。欧洲龙虾（H. gammarus, BL01）的四个物种特异性标志物全部被检出，鉴定明确；但随机森林模型将其误判为挪威龙虾（N. norvegicus），这是唯一一例统计分析的假阳性结果。褐蟹（Cancer pagurus, BL03）的一个标志物被检出，随机森林模型以27.4%的肽段分配比例和p<0.0001的高度显著性支持该鉴定。挪威龙虾（N. norvegicus, BL05）的三个标志物全部被检出，随机森林模型虽p值0.013未达99%显著性水平但仍接近显著。斑点口虾蛄（Squilla mantis, BL09）因蛋白含量极低、样品可能腐败，四个标志物未检出，仅检测到三个已排除的非特异性标志物候选，统计鉴定亦不可行。对于无可用生物标志物的盲样，随机森林模型提供了补充信息：南美白对虾（P. vannamei, BL06）虽无可用标志物，但随机森林模型以24.8%的肽段分配比例和p<0.0001明确鉴定了目标物种，体现了机器学习在无复杂标志物验证情况下的优势。
**基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱** 数据库内部验证显示多数参考条目具有高种内相似性，如褐蟹（C. pagurus）和褐虾（C. crangon）的留一法交叉验证得分均>2.00；但部分物种种内变异显著，如欧洲龙虾（H. gammarus）标本V因取样组织部位不同（腿部与体部）而呈现完全不同的质谱主峰。近缘物种间验证表明，褐虾与Allman小褐虾（C. allmanni）、信号螯虾（Pacifastacus leniusculus）与其他螯虾物种可明确区分。然而，数据库覆盖不足导致了假阳性：零售样品中的拟对虾属（Farfantepenaeus）和部分未入库的Penaeus属物种被误鉴定为南美白对虾。在实验室间比对试验中，六个数据库涵盖物种中有三个被高概率鉴定（欧洲龙虾、挪威龙虾、南美白对虾），褐蟹鉴定质量有限（得分1.90），蓝游泳蟹（Portunus pelagicus）因数据库代表性不足（n=1）而鉴定失败，斑点口虾蛄因样品质量问题出现假阴性，蓝虾（P. stylirostris）和拟对虾属物种因系统发育关系相近且数据库存在空白而被假阳性鉴定为南美白对虾。
**方法性能比较** 三种方法各具优势与局限：多重实时荧光定量聚合酶链式反应特异性高、约4小时可得结果，但当前仅涵盖四种市售物种；MALDI-TOF MS分析快速（约60分钟），但依赖全面的数据库覆盖，且样品质量和组织类型影响显著；LC-MS通过靶向MRM可无假阳性鉴定，随机森林模型提供辅助筛查，但流程耗时（3-4天），样品质量与加工状态对结果影响较大。
**研究结论** 全球不断扩张的海产品贸易需要稳健的分析解决方案，以确保甲壳类贸易物种的正确标识和鉴定。本研究提出三种不同方法，为食品控制实验室提供了广泛的分析选择，其可靠性取决于所采用的具体方法和特定分析需求。然而，分析方法仍存在待填补的空白，特别是纳入更多尚未被代表的物种，以及适应已建立的参考数据。这一需求突显了复杂分析任务方法开发中的主要持续挑战，即合适参考材料的可获得性。研究强调了收集和验证此类参考材料所需的大量工作和时间，以建立可靠且经过充分验证的分析方案。为实现更高级别的快速、经济高效的方法开发，必须建立经认证参考材料的便捷获取途径，因为孤立的内部方法将不可持续。共享和交换参考材料及测量数据是实现高效进展的关键选择。标准化的MALDI-TOF MS非常适合质量已验证数据库条目的数据交换，接收实验室可将其整合到自己的数据库中。然而，当前的数据库覆盖范围可能尚不足以完全满足控制实验室的广泛分析需求。多重聚合酶链式反应方法对选定目标物种的高度特异性使其特别适合标准化。从分析角度来看，LC-MS生物标志物经过高度验证且可在不同设备间转移的物种特异性质量转换也适合标准化，但部分商业相关甲壳类物种的生物标志物仍然缺失。尽管基于蛋白质的方法被证明适用于物种鉴定，但LC-MS或MALDI-TOF-MS技术对样品质量的依赖性更强，而DNA即使从轻微受损的样品（如热降解或酶解）中仍可提取。特别是，本研究描述的实时荧光定量聚合酶链式反应方法非常适合扩增短DNA片段，产生的扩增子大小范围为117 bp至177 bp。附加的随机森林模型为物种鉴定提供了有用的筛查工具，这是该模型首次在实际条件下应用。该统计模型在大多数情况下确认了基于生物标志物的LC-MS数据。因此，未来开发应考虑将人工智能不仅作为随机森林机器学习方法，还应用于分析数据评估（如潜在标志物肽段的识别、特异性验证），以增强和扩展仪器分析方法的检测能力。
