《Journal of Food Protection》：Salmonella in surface water: methodology, complexity, and challenges
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沙门氏菌（Salmonella enterica）是全球范围内的重要病原体，据估计每年导致1.76亿例疾病和29万例死亡。尽管肉类和家禽产品常与此类疾病相关，但农产品相关暴发也是沙门氏菌病的重要诱因。近期暴发事件的溯源调查已将地表水确定为沙门氏菌的储存宿主，受
沙门氏菌（Salmonella enterica）是全球范围内的重要病原体，据估计每年导致1.76亿例疾病和29万例死亡。尽管肉类和家禽产品常与此类疾病相关，但农产品相关暴发也是沙门氏菌病的重要诱因。近期暴发事件的溯源调查已将地表水确定为沙门氏菌的储存宿主，受污染的地表水被用于农产品灌溉。全球研究已在溪流、池塘、河流和湖泊等多种地表水源中持续检出沙门氏菌。尽管该病原体在水体中的流行率已被充分表征，但针对影响地表水中沙门氏菌流行、存续及潜在食品安全风险预测因子的研究结论尚不一致。这限制了有效风险评估及缓解策略的实施，因此地表水仍是重要的食品安全风险来源。本综述阐述了美国现行的食品安全法规，以及沙门氏菌进入地表水并在其中存活的可能途径。此外，还概述了当前的采样方法、流行率研究，以及目前已探明的、影响水体中沙门氏菌潜在风险的相关因素。
引言
沙门氏菌（Salmonella enterica）属于肠杆菌科，为革兰氏阴性、具鞭毛、兼性厌氧的细菌，目前共分为6个亚种：肠道亚种（enterica，Ⅰ）、萨拉姆亚种（salamae，Ⅱ）、亚利桑那亚种（arizonae，Ⅲa）、双亚利桑那亚种（diarizonae，Ⅲb）、豪滕亚种（houtenae，Ⅳ）和印度亚种（indica，Ⅵ）。这6个亚种可通过生化试验区分表型和代谢特征，且通常占据不同的生态位。与其他亚种不同，肠道沙门氏菌肠道亚种（S. enterica subsp. enterica）进化迅速，以适应定植温血动物，占人类临床感染的99%以上。该亚种内部多样性极高，依据怀特-考夫曼-勒米诺（White-Kauffman-Le minor）分型方案可分为近1600个血清型。沙门氏菌血清型通过检测表面抗原进行表型区分，包括菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原和荚膜（Vi）抗原，并可划分为伤寒沙门氏菌和非伤寒沙门氏菌（NTS）两类。伤寒血清型包括伤寒沙门氏菌（Typhi）、仙台沙门氏菌（Sendai）、甲型副伤寒沙门氏菌（Paratyphi A）、乙型副伤寒沙门氏菌（Paratyphi B）和丙型副伤寒沙门氏菌（Paratyphi C），是伤寒（肠热症）和副伤寒的致病菌，这类疾病常直接与接触被粪便污染的水相关。非伤寒沙门氏菌通常不会引发肠热病，多引起自限性胃肠道炎症即沙门氏菌病，部分情况下可导致更具生命威胁的侵袭性肠外菌血症。
沙门氏菌为肠道病原体，因食用未煮熟的污染食品或接触携带沙门氏菌的动物（如宠物、野生动物）引发的暴发符合预期。值得注意的是，农产品也是沙门氏菌暴发的主要贡献者，2012年以来美国每年因沙门氏菌导致的疾病中，农产品占比显著。此类暴发的发生前提是农产品直接或间接被粪便物质污染，因此需明确农产品污染的来源与途径。果蔬中食源性病原体的污染来源十分多样，包括施用污染的土壤或土壤改良剂，这些物质可转移至生长中的植株，或在降雨和灌溉后飞溅至农产品表面。沙门氏菌还可通过采收前施用污染的生产用水进入农产品，经花器、气孔，可能还有根系侵入植株；一旦定植于植物，采收后干预措施难以根除该病原体。此外，沙门氏菌对干燥、酸等轻度胁迫的适应性会增强其侵入叶菜的能力。
2024年黄瓜暴发事件导致551人患病、155人住院，病原体为布拉登鲁普沙门氏菌（Braenderup）和非洲沙门氏菌（Africana），溯源指向使用受污染的运河灌溉水。另有多个农产品暴发事件均与污染用水相关，包括2023年洋葱暴发、2020年红洋葱暴发、2008年辣椒暴发和2005年番茄暴发。研究表明，灌溉水可作为沙门氏菌及其他食源性病原体的储存库，并在作物生长期间传播至农产品。市政供水和井水虽存在污染风险，但风险低于地表水且不均等；然而高昂的抽取成本或抽水限制使许多生产者无法使用这两类水源。地表水用于灌溉十分普遍，但其食品安全风险最高，上游污染可来自野生动物、农业径流或污水泄漏。灌溉水中的细菌负荷可通过氯化、过氧乙酸和紫外线辐射等方法有效处理，但这些方法的广泛应用通常劳动强度大，且需要严格的监测以确保效力。
食品安全法规
美国《食品安全现代化法案》（FSMA）于2011年通过，是美国70多年来最全面的食品安全法律改革，其中包含《农产品安全规则》，旨在降低农产品种植、收获和包装过程中沙门氏菌等病原体污染的风险，该规则确立了基于科学的最低安全标准，以减少农产品受食源性病原体污染的可能性，合规要求可显著降低相关风险。
现行联邦法规基于对农产品环境中危害的既定分析。危害指可能导致食品对人类消费不安全的任何生物、化学或物理属性，如污染的水、未经适当处理的土壤改良剂或野生动物侵入农田。研究人员已完成大量工作来表征这些危害，但仍需更多工作将其转化为风险分析。风险是危害导致不良后果的可能性和后果，例如受沙门氏菌污染的灌溉水是危害，而农业径流导致灌溉水污染或污染水处理无效则属于风险。农产品环境中的风险评估需要结合农场特有特征的广泛分析，包括邻近土地利用、卫生实践及其他相关影响因素。《农产品安全规则》中对农业用水的特定要求旨在减少沙门氏菌和其他食源性病原体的引入，最终规则要求生产者每年至少开展一次农业用水评估，且在发生可能引入新危害的重大变化后也需进行评估。该评估鼓励生产者评估水体系统中病原体入侵的潜在位点，并据此管理风险，评估要点包括初始水源与水质、输配系统性质、用水实践、作物特征、环境条件、邻近土地利用及其他相关因素，生产者还可采用水样检测或处理等措施评估和降低污染风险。
对于使用地表水的农产品生产者，可结合微生物检测和缓解策略以提高使用优质水的概率，但目前采收前用水不要求进行检测。现有检测无法直接快速检出沙门氏菌，多数检测针对水体中的总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希菌（E. coli），因其可作为粪便污染的指示菌。但有研究表明，这些指示物种与沙门氏菌的相关性并不一致。尽管已有法规防止不安全用水，但农产品沙门氏菌暴发仍持续指向灌溉水源污染，这凸显了深入理解地表水中沙门氏菌的迫切需求。
沙门氏菌在地表水中的引入与存活
沙门氏菌可通过人类和动物的直接或间接污染进入地表水。野生动物或牲畜接触水体时可造成粪便污染；人类污水也常排入河流，带来新的微生物及促进微生物增殖的新鲜营养物质，即使污水处理可降低其微生物影响，研究仍在回归地表水的处理污水中检出沙门氏菌。间接污染多以径流形式发生，降水事件可将粪便物质冲刷至低洼处并最终汇入地表水源，农业区域动物密度更高，其影响可能更大，但文献中关于此类关联的证据有限。一项针对农业流域（家禽和养牛业）为期两年的水体沙门氏菌研究显示，全基因组测序结果表明分离株与NCBI病原体检测数据库中的食品动物分离株不匹配或无密切亲缘关系，提示可能存在替代动物储存宿主，最可能为野生动物。野生动物的贡献可为直接或间接，且因物种行为而异（如浣熊有固定排泄场所，更可能发生间接污染）。此外，若植物农业生产中使用处理不当的生物改良土壤，降水或灌溉后也可被冲刷进入水体。屏障和处理措施可限制此类径流，但通常成本较高，降低了措施的可持续性。
在水体中，沙门氏菌需克服多种胁迫才能存活，包括渗透压、氧化应激、pH值、温度和辐射，以及必需营养物质的极度稀释。部分研究认为沙门氏菌在水体中以代谢不活跃状态存续，或以次优状态存活直至重新进入宿主；另一种可能是沙门氏菌可进行增殖，既可在浮游状态下，也可在生物膜或自由生活的原生动物内增殖。沙门氏菌还可从溪流沉积物中分离得到，沉积物可能是地表水中沙门氏菌的另一储存库。既往研究表明，在不添加任何营养物质的淡水中，可存活的沙门氏菌在300天后仍可检出，接种至无菌水中的沙门氏菌甚至在5年后仍可检测到。也有研究观察到紫外线照射会导致沙门氏菌活力显著下降，进入活的非可培养状态（VBNC），该机制或可解释沙门氏菌在水体中长时间存续的现象。
地表水中沙门氏菌的采样方法
地表水样中沙门氏菌的检测与分离最常用两种方法：摩尔拭子（Moore swabs）和膜过滤法。摩尔拭子为无菌纱布块，中部系紧后置于采样环境中24~48小时，游离的沙门氏菌可被截留在纱布纤维中，随后收集纱布并接种至培养基。改良摩尔拭子效率更高，现场采集时间为2~30分钟，将更大的纱布块紧密卷起放入PVC盒中，泵送0.1~10 L水通过该纱布过滤器，主动截留流经盒子的沙门氏菌，而非依赖传统摩尔拭子的被动捕获，后续操作与传统摩尔拭子类似。膜过滤法通常先收集设定体积的水样（一般为100 mL~1 L），通过真空过滤完成过滤，部分方案会在水样中添加珍珠岩“池式”滤料。美国疾控中心开发的死端超滤法（DEUF）灵敏度更高，可在现场将最多100 L水泵过小滤膜，再将滤膜反向冲洗至100~500 mL溶液中，后续进行培养。
样品采集后，沙门氏菌检测可采用依赖培养的方法或不依赖培养的方法。沙门氏菌培养耗时费力，结果出具需长达一周。不依赖培养的方法如针对invA基因等的PCR检测速度快得多，但也可能检出死亡或无活性的沙门氏菌，导致假阳性。
各类方案各有优劣，选择研究方法时需考量。摩尔拭子可分析一段时间内水体中的沙门氏菌种群动态，改良摩尔拭子可调整采样水量，便于当日完成采集，研究显示10 L样品的沙门氏菌回收率分别是0.1 L和1 L样品的43倍和25倍。膜过滤法因采样体积更大且具有滤膜浓缩步骤，灵敏度高于摩尔拭子，且反冲洗液可分装至多种生长条件，实现单一样品中多种微生物的检测。摩尔拭子成本低、易操作，但需次日返回采样点，时间效率较低。不同检测与培养方法的差异导致跨研究结果比较困难，一项系统综述发现，水体采样研究中近20%的变异可归因于方法学和非方法学因素，因此跨项目推论需谨慎，也凸显了对可及、标准化的水体采样方法的需求。
水体中的沙门氏菌流行率
沙门氏菌作为肠道病原体，理论上水生环境对其不利，但多项国内和国际研究均显示水体中沙门氏菌流行率较高。美国境内已对东南部、西海岸、中大西洋和东北部地区开展了大量研究，东南部研究的流行率范围为4%~100%，中大西洋地区为4%~65%，东北部（纽约、宾夕法尼亚州）为11%~49%，西海岸集中于加利福尼亚农业区，流行率为6%~65%。国际研究覆盖全球多个区域，沙门氏菌流行率在7%~92%之间波动。这些研究证实地表水中可常规检出沙门氏菌，但其流行率存在区域差异，很可能与不同环境因素有关，例如温度会影响沙门氏菌流行率，这可能是北部州流行率较低、南部研究流行率较高的原因之一。
除区域差异外，水体类型也会影响沙门氏菌流行率。河流、溪流等流动水源的研究中，超过50%的样品可检出沙门氏菌；而池塘或农业蓄水设施等静水的研究中，沙门氏菌检出率通常低于25%。这提示沙门氏菌可能受益于大型流域和河流中的营养物质循环或微生物群落混合，水流还可能更频繁地将沉积物中生存的沙门氏菌重新带入水体，也更可能冲刷含沙门氏菌的生物膜群落，从而导致流动水体中流行率更高。
水体中的多血清型种群
沙门氏菌常以包含两种及以上血清型的种群形式存在，这种多血清型种群已在地表水、食用动物和野生动物等多种环境中被鉴定。含有多种血清型的样品会带来分析难题，多数沙门氏菌分离方案仅挑选1~3个菌落，大概率仅能获得种群中占优势的血清型。尽管可通过观察琼脂上的菌落形态、使用多种选择性增菌培养基部分缓解这一问题，但挑选少量菌落会导致低丰度血清型无法被检出，可能造成样品临床相关性误判，包括遗漏抗生素耐药性，或遗漏致病性更强的血清型。此前对一条大河和四条独立溪流的评估显示，阳性样品平均分别检出3种和3.7种血清型，阳性样品中多血清型种群的比例分别为80%和89%，甚至有单个样品中检出多达13种血清型的案例，这种复杂度在食用动物等单一来源中并不常见，提示地表水在生态系统中可能扮演“汇集点”角色，收集来自多个来源的沙门氏菌，也说明地表水是多样且复杂的沙门氏菌种群的重要储存库。近期研究还显示，同一地点采集的三份重复水样可检出不同的沙门氏菌血清型，因此水体监测需评估沙门氏菌的多血清型动态。
此外，部分血清型如吉夫沙门氏菌（Give）在地表水研究中频繁检出，且跨区域研究均有发现，提示部分沙门氏菌血清型可能已适应水体环境，需进一步评估这类适应性，识别支持血清型在水环境中适应性提升的性状，若这些性状存在于高风险血清型中，将有助于未来的水体风险评估。
影响水体中沙门氏菌潜在风险的环境因素
由于沙门氏菌培养耗时较长，且风险分析比危害分析更具实用价值，研究人员希望建立模型，明确与水环境中沙门氏菌状态密切相关的环境和气候因素，以支撑预测性风险管理，尤其是针对农产品灌溉用水场景。但将沙门氏菌流行率与环境因子关联的研究结论存在冲突，且并非所有研究都在相关流域开展。多项研究发现沙门氏菌流行率与较高温度（包括气温和水温）呈正相关，另有研究显示降水量与沙门氏菌回收率升高相关，但也有研究未发现降雨或温度与沙门氏菌状态的关联，少数研究发现了负相关，例如电导率，但并未在不同研究中重复出现。沙门氏菌流行率与大肠埃希菌等指示物种的关联也不一致，部分研究为正相关，另一些则为负相关或无关联。一项在佛罗里达州南北部开展的同方法研究显示，两个区域的模型无重叠变量。不同研究中各变量的贡献不一致，凸显了理解哪些因素对水体中沙门氏菌流行率影响最大的挑战，需进一步明确这些因素如何影响沙门氏菌在地表水中的引入和存活性，以构建可靠的风险评估模型。随着分子工具的进步，替代方法可包括基于沙门氏菌载量、血清型种群复杂度或单个血清型的预测建模。
结论
沙门氏菌在环境中的普遍存在及其在宿主间长期存活的能力构成了公共卫生挑战。深入理解污染途径及影响地表水等环境沙门氏菌储存库的因素，对改善食品安全和公共卫生至关重要。随着极端天气事件的影响日益加剧，需更全面地表征生物和气象变量的作用。随着更稳健的采样策略和诊断工具的发展，解决这些问题具备可行性，但仍需大量努力填补当前的知识空白，包括明确地表水污染的贡献来源、影响沙门氏菌在水体中存活性的因素，以及防止病原体从水体向农产品传播的适宜且可行的缓解策略。填补这些空白依赖于统一的沙门氏菌分离和检测方法。
