人参皂苷Rh7通过SIRT1/FOXO1/β-catenin通路促进巨噬细胞M2极化改善糖尿病心肌病心肌损伤

《Journal of Ginseng Research》：Ginsenoside Rh7 Ameliorates Myocardial Injury in Diabetic Cardiomyopathy by Promoting M2 Polarization of Macrophages via SIRT1/FOXO1/β-catenin

　　

本研究旨在探讨人参皂苷Rh7对糖尿病心肌病（Diabetic Cardiomyopathy, DCM）心肌功能障碍的干预作用。研究人员采用高脂饮食联合链脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）建立DCM小鼠模型，并给予人参皂苷Rh7处理。采用超声心动图检测小鼠心脏功能变化，测量小鼠体重、心脏重量及心脏指数；苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin, H&E）染色检测心脏病理改变；组织化学和荧光染色检测心脏组织中CD206和SIRT1（Silent Information Regulator 1）的表达；酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）检测M1/M2细胞标志物水平。结果显示，Rh7可通过抑制SIRT1表达，促进FOXO1（Forkhead Box O1）/β-catenin复合物激活及巨噬细胞M2极化，从而改善DCM小鼠心脏功能障碍。体外诱导型骨髓来源巨噬细胞（induced Bone Marrow-Derived Macrophages, iBMDM）实验显示，Rh7可促进CD206表达及巨噬细胞M2极化。小分子-蛋白对接和Pull-down实验证实了Rh7与SIRT1的结合关系。结论表明，Rh7通过抑制SIRT1并激活FOXO1/β-catenin通路，促进巨噬细胞M2极化，从而改善DCM小鼠心肌损伤。

人参（Ginseng）为五加科（Araliaceae）植物，具有广泛的药理作用和医用价值。人参皂苷（Ginsenosides）是人参的主要活性成分，已鉴定结构的单体超过30种，属于三萜皂苷（Triterpenoid Saponins），可分为二醇型（如人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rh2等）、三醇型（如人参皂苷Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1等）和齐墩果酸型（如人参皂苷R0、Rh3等）。研究表明，人参皂苷对动物心肌缺血再灌注损伤及人类体外循环手术具有保护作用。人参皂苷Rg1、Rb1、Re等主要成分对缺氧诱导的血管内皮细胞损伤具有显著保护效应，提示人参可能具有促进血管生成（Angiogenesis）的潜力，可改善心肌微循环、增加冠状动脉血流量。人参皂苷Rh7属三醇型皂苷，是一种新型人参皂苷，其药理作用及机制研究较少。鉴于其他人参皂苷在心血管疾病中的作用，深入探讨Rh7的药理效应具有重要价值。

巨噬细胞（Macrophages）在心血管疾病尤其是心肌损伤中发挥重要作用。巨噬细胞作为免疫细胞，具有免疫应答和抗原呈递等功能，可分为M1型和M2型：前者具有促炎作用，后者具有抗炎作用。心肌损伤过程中，M1型巨噬细胞早期激活，介导炎症反应和氧化应激，清除应激产生的有害物质；后期M2型巨噬细胞激活，增强抗炎作用，维持自噬（Autophagy）平衡，延缓心室重构（Ventricular Remodeling）。M2型巨噬细胞的激活对心肌细胞具有保护作用，因此调控巨噬细胞极化是治疗心肌损伤的重要手段之一。SIRT1是一种NAD⁺依赖性组蛋白去乙酰化酶（Histone Deacetylase），参与调控代谢、衰老、细胞存活、自噬及糖尿病等病理生理过程。SIRT1可去乙酰化并激活多种蛋白和转录因子，FOXO1即为其靶点之一。FOXO1参与细胞抗氧化应激、凋亡、细胞周期阻滞、胰岛素信号及代谢调控。SIRT1介导的FOXO1去乙酰化选择性引导FOXO1作用于特定靶点，构成代谢和应激反应的另一调控通路。进一步研究表明，SIRT1介导FOXO1的Lys242、Lys245和Lys262位点去乙酰化而激活其功能。FOXO1作为转录因子调控β-catenin的激活和活性，而β-catenin是促进巨噬细胞M2极化的重要蛋白。M2型细胞在组织修复中发挥重要作用，分泌大量Arg-1、IL-10、TGF-β1等因子促进细胞再生和修复。

研究人员针对SIRT1-FOXO1/β-catenin通路开展Rh7效应研究，采用高脂饮食联合链脲佐菌素（STZ）诱导建立DCM小鼠模型，并通过三个实验进行验证：实验一采用32只C57BL/6J小鼠分为Control组、DCM组、Rh7低剂量组（12.5 mg/kg）和Rh7高剂量组（25 mg/kg）；实验二采用24只FOXO1基因敲除（FOXO1^-/-）小鼠分为Control组、DCM组和Rh7组（25 mg/kg）；实验三采用32只C57BL/6J小鼠分为Control组、IN-3组（β-catenin抑制剂，10 mg/kg）和IN-3+Rh7联合用药组（10 mg/kg IN-3 + 20 mg/kg Rh7）。同时开展体外iBMDM细胞实验，采用IL-4/13诱导M2极化，预先用5 μM和10 μM Rh7处理6小时。主要技术方法包括：超声心动图检测心脏功能指标（LVID,d、LVID,s、LVEF、LVFS、IVS,s、IVS,d）、H&E染色观察心肌病理、ELISA检测M1/M2细胞标志物（TNF-α、IL-6、IL-1β、Arg-1、IL-10、TGF-β1）、组织荧光染色检测SIRT1和CD206表达、Western Blot检测蛋白表达水平、小分子-蛋白对接及分子动力学模拟分析Rh7与SIRT1结合特性、Pull-down实验验证二者靶向结合关系。

Rh7改善DCM小鼠心脏功能障碍。DCM小鼠表现出显著心肌损伤和明显心脏功能障碍。Rh7处理可改善小鼠心肌损伤，降低炎症因子表达，增加CD206⁺巨噬细胞比例。DCM小鼠因糖尿病导致体重显著下降，Rh7可抑制该体重减轻；DCM组心脏重量和心脏指数显著低于Control组，且心脏出现明显病理改变，Rh7显著增加心脏重量和心脏指数。空腹血糖（Fasting Blood Glucose, FBG）检测显示DCM小鼠FBG显著高于Control组，Rh7可降低FBG水平。心脏功能检测显示DCM组LVEF、LVFS、IVS,s和IVS,d显著低于Control组，而LVID,s和LVID,d升高，Rh7显著改善这些参数。H&E染色显示DCM组存在明显心肌细胞损伤和炎症反应，Rh7显著改善。M1/M2细胞因子检测显示DCM组M1标志物IL-6、IL-1β和TNF-α水平高于Control组，Rh7降低炎症因子表达；M2标志物Arg-1、IL-10和TGF-β1在DCM组与Control组间无显著差异，但Rh7可提高这些细胞因子水平。SIRT1染色显示DCM组SIRT1阳性率高于Control组，Rh7降低SIRT1阳性率。CD206染色显示DCM组与Control组CD206⁺阳性细胞比例无差异，但Rh7增加CD206⁺阳性细胞比例。蛋白相对表达水平显示DCM组SIRT1显著高于Control组，FOXO1和β-catenin略有升高，Rh7降低SIRT1并升高FOXO1和β-catenin水平。

Rh7对FOXO1^-/-DCM小鼠无显著作用。FOXO1是SIRT1下游信号，调控M2极化。研究人员发现，尽管Rh7可抑制DCM中SIRT1表达，但无法进一步改善FOXO1^-/-小鼠心肌损伤，表明Rh7作用于SIRT1上游信号。检测显示Rh7抑制小鼠体重减轻，但心脏重量和心脏指数在DCM与Rh7间无显著差异；FBG无显著差异；LVEF、LVFS、IVS,s、IVS,d、LVID,s和LVID,d均无显著差异；H&E染色显示两组均存在明显细胞损伤和炎症反应，无显著差异。M1和M2标志物检测显示DCM与Rh7间M1标志物IL-6、IL-1β和TNF-α无显著差异，M2标志物Arg-1、IL-10和TGF-β1水平亦低，与Control组无显著差异。SIRT1染色显示Rh7组显著低于DCM组，表明Rh7对SIRT1有显著抑制作用；但CD206染色显示DCM与Rh7间阳性率无显著差异，与Control组亦无显著差异。蛋白表达显示Rh7组SIRT1显著低于DCM组，FOXO1无显著表达，β-catenin水平在Rh7与DCM间无显著差异。

抑制β-catenin可拮抗Rh7改善DCM心肌损伤的效应。FOXO1/β-catenin复合物促进巨噬细胞M2极化，β-catenin是关键信号分子。研究人员使用β-catenin抑制剂IN-3阻断下游信号，结果显示IN-3与DCM间心脏功能无显著差异，IN-3+Rh7亦未进一步改善DCM小鼠心脏功能，表明Rh7作用于上游SIRT1而非FOXO1/β-catenin复合物。体重检测显示DCM、IN-3和IN-3+Rh7间无显著差异，但均低于Control组；心脏重量和心脏指数三组间无显著差异；FBG水平IN-3和IN-3+Rh7与DCM相比有显著差异，水平较低。心脏功能检测显示DCM、IN-3和IN-3+Rh7间LVEF、LVFS、IVS,s、IVS,d、LVID,s和LVID,d均无显著差异；H&E染色显示三组均存在显著心肌细胞损伤，无显著差异。M1/M2标志物检测显示三组间M1和M2标志物均无显著差异，尤其M2标志物与Control组无显著差异。SIRT1染色显示IN-3与DCM间阳性率无显著差异，但IN-3+Rh7显著低于DCM和IN-3，β-catenin抑制不影响上游SIRT1表达。CD206检测显示DCM、IN-3和IN-3+Rh7间无显著差异，虽略高于Control组。蛋白表达显示Rh7增加FOXO1水平并降低SIRT1表达。

Rh7与SIRT1的结合关系。小分子-蛋白对接结果显示SIRT1蛋白受体上Lys436、Val404、Asn338和Ser434与Rh7形成氢键相互作用；Val258、Ala254、Arg458、Ile339、Val437和Phe406与Rh7形成疏水相互作用；Arg458与Rh7形成碳氢相互作用。分子动力学模拟100 ns评估化合物与蛋白靶点相互作用，均方根偏差（Root-Mean-Square Deviation, RMSD）约40 ns达到平衡，平均RMSD为21.47 ?；均方根涨落（Root-Mean-Square Fluctuation, RMSF）变化范围1.43-24.08 ?，平均8.95 ?；回转半径（Radius of Gyration, Rg）在30.17-39.72 ?间波动，平均32.70 ?，复合物系统相对稳定。氢键数量在2-7间波动，平均4.40个，与对接结果一致。自由能景观显示存在多个分散的最低能量簇，可能是Rh7与SIRT1高亲和力和稳定性的原因。Pull-down实验证实Rh7与SIRT1存在结合关系，点突变后Rh7失去结合位点不再具有结合能力，与对接结果相互印证。

Rh7促进iBMDM细胞M2极化。IL-4/13可诱导iBMDM细胞M2极化，Arg-1、IL-10和TGF-β1水平显著高于Control组。Rh7可进一步增加这些细胞因子表达，Rh7组显著高于IL-4/13组。免疫荧光结果显示CD206为M2细胞标志物，IL-4/13组CD206荧光强度显著高于Control组，Rh7进一步增加CD206表达，荧光强度显著高于IL-4/13组。相对蛋白表达检测显示Rh7抑制SIRT1表达，增加FOXO1和β-catenin水平。

讨论部分，研究人员进一步阐释了SIRT1-FOXO1/β-catenin信号轴在Rh7调控巨噬细胞极化中的分子机制。SIRT1作为NAD⁺依赖性组蛋白去乙酰化酶，通过去乙酰化修饰调控FOXO1转录活性，进而影响β-catenin介导的M2极化进程。Rh7作为新型三醇型人参皂苷，通过直接结合SIRT1蛋白并抑制其功能，解除对FOXO1的抑制作用，促进FOXO1/β-catenin复合物激活，最终驱动巨噬细胞向M2型极化，发挥抗炎和组织修复效应。研究人员指出，在DCM模型中，Rh7显著改善心肌损伤，抑制炎症损伤，结合SIRT1抑制其功能，促进FOXO1/β-catenin激活和巨噬细胞M2极化。该研究同时存在局限性：需进一步研究Rh7的药代动力学和安全性，并在其他心肌损伤模型中探讨其药理作用及机制，以提供更全面的应用支持。

研究结论：人参皂苷Rh7作为新型三醇型人参皂苷，对心肌损伤具有治疗作用。在DCM模型中，Rh7显著改善小鼠心肌损伤，抑制炎症损伤，通过与SIRT1结合抑制其功能，促进FOXO1/β-catenin激活及巨噬细胞M2极化。