核定位信号瓜氨酸化干扰生长抑制因子4（ING4）与输入蛋白α3（importin α3）的结合

《Journal of Molecular Biology》：Citrullination at the nuclear localization signal of the inhibitor of growth 4 (ING4) interferes with its binding to importin α3

　　

生长抑制因子4（ING4）作为肿瘤抑制因子调控染色质结构，其核功能依赖核定位信号（NLS）被细胞转运 machinery 识别——该 machinery 主要由输入蛋白家族构成，其中包括亚型输入蛋白α3（importin α3），介导ING4穿过核膜。肽基精氨酸亚氨基水解酶（PADIs）是一类催化精氨酸发生瓜氨酸化的翻译后修饰酶，人类5种PADI亚型之一的PADI4可对ING4的NLS区域进行瓜氨酸化修饰。研究人员通过多种生物物理技术与分子模拟，在体外与计算机模拟层面探究了不同瓜氨酸化程度如何影响ING4 NLS与PADI4、importin α3及其缺失importin结合域的截短体（Δimportin α3）的结合。为此，研究人员合成了涵盖ING4 NLS（残基130至152）的8条多肽，分别在Arg132、Arg142、Arg144位点引入单、双、三重瓜氨酸替换。扩散排序谱（DOSY）、一维及二维氢核磁共振（1D-/2D-1H-NMR）实验证实所有多肽均为单体且无序状态。所有多肽均能以低微摩尔级亲和力结合PADI4，且亲和力随瓜氨酸化比例升高而降低；同时所有多肽均可结合两种importin物种，亲和力同样处于低微摩尔范围且受瓜氨酸化程度调控。多肽均靶向两种importin物种的货物蛋白经典NLS结合位点。研究结果表明：（i）NLS区域的瓜氨酸化可能干扰ING4的核转运；（ii）NLS区域的连续瓜氨酸化会影响其与PADI4的结合。

本研究由西班牙米格尔·埃尔南德斯大学IDIBE团队完成，发表于《Journal of Molecular Biology》，聚焦生长抑制因子4（ING4）核定位信号（NLS）的瓜氨酸化修饰对其核转运功能的调控机制。ING4是ING家族肿瘤抑制因子，通过调控组蛋白乙酰化、p53及NF-κB转录活性参与细胞周期阻滞、凋亡、血管生成等关键过程，其核定位依赖importin α3（Imp α3）介导的转运通路；肽基精氨酸亚氨基水解酶4（PADI4）是催化精氨酸向瓜氨酸转化的翻译后修饰酶，在多种癌症中高表达且与底物结合调控其功能。此前研究已证实PADI4可瓜氨酸化ING4的NLS区域，但该修饰如何影响ING4与Imp α3及PADI4自身的结合尚不明确，而这是解析ING4核定位调控机制的核心问题。

研究人员针对上述问题，合成了8种覆盖ING4 NLS（残基130–152）的多肽，包含野生型及Arg132、Arg142、Arg144的单、双、三重瓜氨酸突变体，综合运用扩散排序谱（DOSY）、核磁共振（NMR）、等温滴定量热法（ITC）、生物层干涉技术（BLI）及分子对接模拟开展研究。

研究结果如下：

ING多肽的构象特征：DOSY与NMR实验表明，所有多肽均为单体，水溶液中呈无序状态，化学位移符合无规卷曲特征，且未检测到长程NOE信号，瓜氨酸化未改变多肽的整体无序属性。

ING多肽可结合Imp α3与ΔImp α3：荧光滴定无法获得可靠解离常数，ITC结果显示所有多肽均以低微摩尔级亲和力结合两种importin，亲和力随瓜氨酸化数目增加而下降，ΔImp α3的亲和力略高于全长Imp α3；BLI实验进一步验证了亲和力变化趋势，发现瓜氨酸化会降低结合速率常数（k_on），而对解离速率常数（k_off）影响较小。

ING多肽可结合PADI4：ITC仅能检测到野生型多肽的结合信号（K_d≈7.7 μM），其余突变体无显著热量变化；BLI实验则显示所有多肽均可结合PADI4，亲和力随瓜氨酸化升高而降低，同样由k_on下降主导；颜色法测定证实野生型多肽可被PADI4催化瓜氨酸化，直接证明其靶向酶活性中心。

ING多肽的靶向结合位点：分子对接模拟显示，所有多肽均靶向Imp α3的主要NLS结合位点（含Trp137、Trp222、Trp264等色氨酸残基），以及PADI4的催化中心（邻近催化残基Cys645），与荧光实验中色氨酸微环境变化的观测结果一致。

结合速率常数与序列电荷分布的关联：通过CIDER工具分析多肽序列发现，结合速率常数（k_on）与电荷分隔参数κ呈近似线性相关，提示NLS序列中正负电荷的混合程度可调控结合效率。

讨论部分指出，本研究首次在体外明确了NLS区域瓜氨酸化对ING4与importin及PADI4结合的负调控作用：每增加一个瓜氨酸化位点，多肽与两种蛋白的亲和力逐步下降，三重突变体的亲和力较野生型降低约4倍。这一效应源于精氨酸带正电侧链的丢失，削弱了与importin NLS结合位点（富含酸性残基）及PADI4催化中心（带负电口袋）的静电相互作用。尽管体外实验无法直接等同于细胞内效应，但结合既往研究报道的ING4瓜氨酸化会抑制其与p53结合并促进降解的结论，可推测NLS瓜氨酸化可能通过干扰核转运进一步削弱ING4的抑癌功能。此外，野生型ING NLS多肽可竞争性结合PADI4的活性中心，有望作为先导化合物开发PADI4抑制剂，但需注意其同时结合importin的脱靶效应。与磷酸化、乙酰化等其他可逆翻译后修饰不同，瓜氨酸化是不可逆修饰，且无已知去瓜氨酸化酶，其对蛋白质功能的调控具有独特性。本研究为理解PADI4介导的翻译后修饰在核转运调控中的作用提供了新视角，也为靶向PADI4的抗癌药物研发提供了潜在靶点。

研究最终结论为：ING4 NLS区域的瓜氨酸化程度升高会同时削弱其与importin α3及PADI4的结合能力，进而可能干扰ING4的核定位过程；该修饰也为PADI4调控底物结合提供了反馈机制。