活化免疫细胞在重症肺炎中呈现肺间质-气道/肺泡跨腔室共享模式

《Clinical and Translational Medicine》：Activated immune cells present a lung interstitial-to-airway/alveolar cross-compartment sharing pattern in severe pneumonia

　　

背景：免疫细胞在重症肺炎的发病机制中发挥关键作用，然而该条件下免疫细胞的全景图谱尚未完全阐明。
方法：研究人员对12例重症肺炎患者和5例供体的配对肺组织、支气管肺泡灌洗液（BALF）及外周血中的275 411个细胞进行了单细胞分析，以识别活化免疫细胞的跨腔室共享模式及其在重症肺炎中的作用。
结果：研究观察到活化免疫细胞分布于肺间质和气道（肺泡）（模式1a），包括活化的组织驻留记忆样CD8+ T细胞（T8_rms）、浆细胞和浆母细胞，以及促炎性巨噬细胞。活化的T8_rms来源于循环中的CX3CR1+ CD8+ T细胞，其在肺浸润过程中上调ITGAE和CXCR3表达。类似地，表达ITGAE和CXCR3的浆细胞和浆母细胞也提示了潜在的肺间质-气道/肺泡共享模式。促炎性巨噬细胞通过CXCL10-CXCR3轴与T8_rms和浆细胞相互作用。
结论：活化免疫细胞的肺间质-气道/肺泡跨腔室共享模式（模式1a）为重症肺炎的临床和转化研究提供了稳健的工作假说。

本研究发表于《Clinical and Translational Medicine》，旨在揭示重症肺炎中活化免疫细胞的跨腔室迁移规律，为临床评估和监测重症肺炎提供新视角。

肺炎是全球发病率和死亡率的主要原因之一，构成重大公共卫生挑战，可由细菌、病毒和真菌等多种病原体引起，在重症病例中可能导致多器官功能障碍。除病原体直接侵袭和毒素释放外，过度激活的免疫反应可导致组织损伤和全身炎症；免疫细胞和炎性渗出物向肺间质和气管腔的浸润显著破坏气体交换，导致持续难治性低氧血症。免疫细胞的分布与迁移对理解重症肺炎发病机制至关重要。既往研究在COVID-19患者的支气管肺泡灌洗液中发现了组织驻留记忆样CD8+ T细胞和促炎性单核细胞衍生巨噬细胞，提示 these cells may originate from the bloodstream and undergo phenotypic changes during lung migration，但直接证据有限，尤其缺乏匹配的外周血、肺组织和支气管肺泡灌洗液样本研究。该知识空白阻碍了对重症肺炎免疫细胞动力学的全面理解。研究人员假设部分免疫细胞可能从外周血迁入肺间质，激活、增殖并经历表型转化，随后在重症肺炎期间进入气道和肺泡。为验证此假说，研究人员招募12例重症肺炎患者和5例对照供体，采用单细胞转录组学和免疫组库分析，首次系统描绘了活化免疫细胞的跨腔室共享模式。

研究样本来自四川大学华西医院，重症肺炎患者纳入医疗重症监护病房并接受机械通气，肺活检标本经BUS-PTNB流程获取，对照为疑似肺癌患者的远端正常肺组织。主要技术方法包括：单细胞RNA测序（scRNA-seq）对275 411个细胞进行转录组分析；T细胞受体测序（TCR-seq）和B细胞受体测序（BCR-seq）追踪淋巴细胞克隆扩增与谱系关系；多重免疫组织化学（mIHC）确定肺组织中炎症细胞的空间分布；流式细胞术进行验证实验；以及单细胞数据整合分析（RPCA工作流程）、TCR分布模式分析、RNA velocity分析预测细胞状态转变轨迹、CellChat推断细胞间通讯、SingleR进行细胞功能状态注释，并结合宏基因组下一代测序（mNGS）进行病原体检测。

研究结果部分呈现了六个主要发现：

"T8_rms在重症肺炎的肺间质和气道（肺泡）中高度活化并增殖"。在T/NK细胞区室中，研究人员鉴定出10个CD8+ T细胞亚群，其中T8_rms以高表达ITGAE和CXCR6为特征，高表达细胞毒性标志物GZMB和GNLY而非记忆标志物IL7R。T8_rms和循环T细胞在肺炎肺组织中构成主要细胞群，较对照肺组织显著增加，且比例呈正相关，提示T8_rms在肺炎期间增殖。病毒感染患者T8_rms比例更高，病毒感染者肺样本中T细胞具有更高的细胞毒性、趋化因子和干扰素诱导标志物表达。基因本体论分析显示T8_rms中多种免疫通路广泛活化。mIHC显示肺炎组GZMB+ CD103+ CD8+ T细胞比例显著升高，多数T8_rms定位于气道（肺泡）；流式细胞术证实COVID-19患者BALF中活化T8_rms和Ki67+ CD103+ CD8+ T细胞丰富，而外周血中KLRG1+ CX3CR1+ CD8+ T细胞显著减少。

"活化的T8_rms呈现肺间质-气道（肺泡）跨腔室共享模式"。通过scTCR-seq数据分析T细胞克隆扩增和迁移行为，CD8+ T细胞较CD4+ T细胞表现出更大的克隆扩增。研究定义三种TCR分布模式：模式1a分布于肺和BALF，细胞类型为T8_rms和循环T细胞；模式1b仅分布于肺，为T8_rms；模式2分布于肺和外周血，为T8_eff和T8_NK-like。STARTRAC迁移分析显示T8_rms和循环T细胞在肺与BALF间TCR共享度高，而T8_em、T8_eff和T8_NK-like簇呈现血液-间质跨腔室共享。模式1a细胞表达更高水平的细胞毒性和增殖基因，提示为活化且具细胞毒性状态；模式1a在病毒感染患者中最突出，但在未检出病原体和部分细菌感染患者中也可检测到。SingleR分析显示对照肺细胞多类似模式1b和2的功能状态，几乎无模式1a特征，表明模式1a功能特征为重症肺炎活化CD8+ T细胞所特有。CD4+ T细胞中，T4_Th1和循环T细胞在患者组显著克隆扩增，且存在肺-BALF的TCR共享模式。

"活化CD8+ T细胞的功能和转变特征"。以乙型流感病毒（IBV）感染患者P6为代表，IBV RNA+细胞中巨噬细胞占主导，主要分布于BALF。CellChat分析显示IBV RNA+细胞与模式1a T细胞的配体-受体相互作用中，MHC-I信号更为突出，提示模式1a细胞可能为IBV特异性T细胞，接受 robust TCR依赖性信号。模式1a中T8_rms和循环T细胞增强的MHC-I信号强度与其间质-气道跨腔室共享模式一致，表明活化T8_rms可能迁移至气道腔并与IBV RNA+细胞通过MHC-I信号相互作用；mIHC共染色证实活化T8_rms与肺泡中IBV+上皮细胞直接接触。RNA velocity分析P10患者过渡性TCR克隆，预测了从PBMC中CX3CR1+ T8细胞到肺和BALF中T8_rms的典型转化轨迹：初期CXCR3显著上调，随后CX3CR1和FGFBP2快速下调；第二阶段CXCR3下调，ITGAE和CXCR6逐渐升高并在转化末期达峰。这提示CX3CR1和CXCR3表达转变可作为CX3CR1+ T8细胞向T8_rms早期转化的标志，CXCR3调控对TRM前体细胞迁入肺间质和气道腔起关键作用。

"浆母细胞和IgA+浆细胞在气道（肺泡）腔中富集"。20 817个B系细胞中鉴定出10个细胞簇，浆细胞和浆母细胞在肺炎组比例显著升高。PB和PC.1在肺和BALF中显著扩增，mIHC检测到IgA+ Ki67+浆细胞和弥散IgA抗体位于黏膜区域和肺泡腔。PB主要为IgG同种型，PC.1富集IgA同种型；二者发育关联，BCR组库有重叠，高表达CXCR3和ITGAE，在肺与BALF间存在显著BCR共享，提示这些细胞活化后迁移至气道（肺泡）以增强黏膜免疫。

"促炎性单核细胞衍生巨噬细胞与其他活化免疫细胞的相互作用"。37 928个髓系细胞中鉴定出7个表型群，tMDM_CCL2簇在肺炎组显著扩增，广泛表达CCL2、CXCL10等趋化因子。mIHC显示P6肺泡腔中大量CD68+巨噬细胞周围有高水平CXCL10；CellChat分析揭示tMDM_CCL2与T8_rms、T4_Th1、PC.1和PB通过CXCL10-CXCR3轴存在显著相互作用，提示气道和肺泡腔中的促炎性MDM可能招募并活化CXCR3表达免疫细胞。AM_FABP4通过CCL23-CCR1轴与tMDM_CCL2相互作用，可能触发早期免疫反应；气道内表面纤毛细胞高表达CCL15，通过CCL15-CCR1轴与tMDM_CCL2相互作用，并可通过CCL28/CCR10、CCL15/CCR1、CXCL16/CXCR6等信号与T/B细胞系发生促迁移作用。

讨论部分，研究人员首先指出该研究阐明了重症肺炎中活化免疫细胞—— specifically T8_rms、浆细胞和促炎性MDM——在肺间质与气道间的跨腔室共享模式，并揭示促炎性MDM通过CXCL10-CXCR3轴与其他活化免疫细胞相互作用，对临床实践和转化研究具有重要意义。由于重症患者肺组织样本获取困难，既往研究多依赖尸检数据或单独使用BALF和PBMC评估肺部炎症，但BALF和外周血何者更好反映肺部免疫细胞群体尚不明确。本研究通过新型活检技术同时获取三种样本，将TCR数据模式分为三组：模式1a包括分布于肺间质和气道的高度活化TRM、浆细胞和促炎性巨噬细胞，与持续感染相关，在COVID-19患者BALF中已有报道；模式1b为肺实质内静息免疫细胞如静息T8_rms和肺泡巨噬细胞，可能无增殖性且与当前感染无关；模式2为从血液迁移至肺部的细胞，在血液中增殖扩增但参与肺部感染有限，虽存在于肺组织但很少出现于气道。通过代表性T细胞克隆分析，研究人员发现部分活化TRM可能源自外周血中抗原应答的CX3CR1+ T_eff，在迁移至肺组织过程中上调CXCR3和ITGAE；CXCR3表达对于适应性免疫细胞迁入气道腔至关重要，而终末分化的T_eff缺乏在浸润过程中上调CXCR3的转变能力，故主要分布于肺和外周血。类似地，IgA+浆细胞也因高表达CXCR3和ITGAE而具备迁移至气道和肺泡的能力。MDM的跨腔室追踪因缺乏特异性标志物而具挑战性，但促炎性和抗炎性巨噬细胞均分布于肺和气道，与活化T8_rms一致，提示其在放大免疫反应中的关键作用。这些发现使BALF成为肺实质炎症的可靠指示指标。

研究结论指出：免疫细胞跨腔室共享模式在肺部保护和炎症中起关键作用，BALF可作为肺实质炎症的替代窗口，对重症肺炎的评估和监测具有深远意义。

本研究局限性包括：患者队列规模小且病因异质，无法进行病原体类别间的正式统计比较；样本量有限限制了单细胞数据的普适性和受试者层面统计；缺乏对照组BALF样本导致TCR模式定义缺乏直接证据；肺活检处理中血管灌注不足意味着无法从物理上排除组织中的血管内免疫细胞，真实组织驻留与组织相关或血管内细胞的区分仅依赖转录标准。研究人员明确称当前证据仅可作为机制线索或工作假说，尚未经基础实验验证，后续研究将聚焦CCL15/23-CCR1和CXCL10-CXCR3轴的靶向调控。