《Journal of Orthopaedic Translation》：Role of collagen VI and IX in mechanotransduction in the cartilage microenvironments: A multiscale in silico examination
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软骨细胞（chondrocytes）为力学敏感细胞，参与关节软骨的生物合成与维持。组织学上，此类细胞被细胞周基质（pericellular matrix, PCM）包绕，该区域以胶原VI（collagen VI）浓度相对较高、胶原IX（collagen IX）
软骨细胞（chondrocytes）为力学敏感细胞，参与关节软骨的生物合成与维持。组织学上，此类细胞被细胞周基质（pericellular matrix, PCM）包绕，该区域以胶原VI（collagen VI）浓度相对较高、胶原IX（collagen IX）浓度相对较低为特征，并在与细胞外基质（extracellular matrix, ECM）交界的区域（即区域基质，territorial matrix, TM）形成过渡。然而，PCM组成及其与ECM的相互作用（如胶原VI、IX含量的改变）对软骨细胞力学行为的影响至今尚不明确。本研究旨在构建多尺度模型，以探究胶原VI与IX在调控细胞及组织层面软骨力学中的作用。
研究人员开发了孔隙-超弹性多尺度有限元（finite element, FE）软骨模型，以建立组织层面聚合载荷与细胞力学之间的关联。该细胞富集型软骨模型纳入了解剖学细胞分布及II、VI、IX型胶原，分别代表ECM与PCM的构建模块网络。在正常及扰动胶原VI与IX非线性属性的条件下，模拟了无约束压缩试验。细胞与组织层面的力学行为通过显式耦合方法进行同步模拟。
在组织聚合层面，软骨反应力随胶原VI的改变而发生显著变化，而在考虑的变化范围内，胶原IX属性的改变对反应力影响甚微。此外，胶原VI与IX刚度的改变与细胞体积、承载负荷及细胞力学微环境的变化相关。
上述结果表明，次要胶原网络能够在宏观软骨反应影响有限的情况下调控细胞力学环境。阐明这一关联将有助于深化理解胶原VI与IX受损条件下（如局部损伤或酶解降解）的细胞功能。
软骨是一种为关节提供结构支撑的结缔组织，由嵌入ECM中的特化细胞——软骨细胞构成，该ECM主要由多种类型的胶原纤维组成，其中含量最丰富的是II型、VI型和IX型胶原。组织学上，软骨细胞被PCM包绕，PCM以相对较高的胶原VI浓度和相对较低的胶原IX浓度为特征，在与ECM交界的TM区域形成过渡。II型胶原纤维提供抗张强度并贡献软骨的整体承载能力。当负荷施加于软骨时，ECM内的胶原纤维产生机械应力，这些力通过TM和PCM传递至组织内的软骨细胞。软骨细胞感知细胞载荷后，其表面的力学敏感受体检测这些力学信号并启动信号级联反应，进而激活包括基因表达和ECM组分合成在内的多种细胞内事件。过度的机械应力可导致软骨细胞内分解代谢通路的激活，促使细胞释放降解ECM组分（包括胶原）的酶。因此，与生化环境并列，微力学状态在调控软骨细胞分解与合成功能以及软骨健康与退变状态中起决定性作用。
除经典的力学和形态学因素外，软骨退变的病理启动和进展与软骨细胞代谢及其微环境的异常变化密切相关，这两个因素互为表里、相互包含。胶原VI和IX作为紧邻软骨细胞的网络结构，其行为改变是影响力转导过程的关键结构组分。这些胶原固有属性的改变将影响软骨细胞的力学刺激，进而改变细胞的代谢功能。识别胶原VI和IX在力转导过程中的相对贡献，将有助于理解软骨细胞在ECM合成与维持中的作用。然而，同时在体外研究软骨微观和宏观尺度的力学行为在技术上极为困难，因此计算生物力学成为获取不同空间尺度间载荷传递机制额外洞见的替代途径。
该研究发表于《Journal of Orthopaedic Translation》。研究人员为开展此项研究，采用了以下主要关键技术方法：构建三维（3D）细胞解析的软骨细胞单元（cartilage cellular unit, CCU）微模型，其中软骨细胞及其包绕基质（PCM和TM）以椭球体形式呈现，外覆逐层薄层结构；利用Abaqus软件的实例再生技术创建基于组织学文献深度依赖性细胞密度的细胞分布，并合并构建模拟无约束压缩试验的宏观3D软骨试样模型；采用孔隙-超弹性多尺度有限元框架，将纤维网络（I型、II型、VI型和IX型胶原）以桁架单元（T3D2）模拟，多孔基质以非线性压力和位移场单元（C3D10MP）模拟，并引入基于孔隙比的应变依赖性渗透性；实施全局敏感性分析以评估参数不确定性对宏观和微观尺度输出的影响，采用拉丁超立方采样和径向基函数（radial basis function, RBF）替代模型进行方差分解；通过显式耦合方法同步求解组织层面反应力和细胞/PCM层面力学，对胶原VI和IX的线性与非线性属性进行±30%的对称扰动，以模拟不同加载工况。
研究结果部分，研究人员首先验证了模型预测与实验数据的一致性。聚合层面模拟结果与DiSilvestro和Suh报告的无约束压缩试验中软骨外植体反应力一致。在峰值加载点，胶原VI刚度改变显著影响反应力：刚度降低30%时反应力从1.282 N降至1.156 N，刚度增加30%时升至1.384 N；但该变异在松弛过程中大幅减小，平衡加载状态下约仅为2%。胶原IX属性改变30%时，峰值加载点反应力变化不足3%，且平衡状态下几乎消失。联合改变两种胶原属性时，宏观反应与单独改变胶原VI类似。
全局敏感性分析量化了ECM、PCM、TM和细胞层面参数对峰值聚合反应力及表层/移行区平均细胞力的相对影响。对于峰值反应力，主导贡献因素为ECM层面参数：II型胶原刚度/体积分数约占输出方差的31%（其中约18%与II型胶原刚度系数的联合作用相关，约13%与表层/移行区胶原体积分数相关），其次为ECM渗透性（约21%）和基质刚度与肿胀应力的联合效应（约15%）。微环境相关参数中，胶原VI约占反应力方差的8%，而胶原IX相关参数对宏观反应方差的贡献显著更小。相比之下，平均细胞力主要由胶原VI和PCM/细胞属性驱动：胶原VI刚度/体积分数贡献约18%的方差，其次为PCM渗透性（约12%）、细胞刚度（约12%）和细胞渗透性（约8%）；胶原IX刚度/结构贡献约7%的方差，而ECM胶原刚度/结构（约9%）、ECM渗透性（约7%）和ECM基质刚度/肿胀（约6%）为次要贡献因素。
增量分析表明，胶原VI刚度从5%增加至40%时，峰值反应力增加约14%，表层平均细胞力降低约29%，与PCM强化和细胞边界应力屏蔽增强一致；而胶原IX刚度同等幅度增加时，峰值反应力改变约3%，表层平均细胞力增加约12%，提示其对细胞尺度的调控作用有限而宏观特征不明显。
个体细胞在正常及改变胶原VI、IX属性条件下承受不同的总环向力。环向力在表层最大（平均118±32 nN），随软骨深度显著递减，在骨-软骨交界层为9±3 nN。胶原VI材料属性增加30%时，表层细胞承载力平均降低39%（P<0.001），呈显著的深度差异性降低（最大39%于表层，最小16%于移行层）。胶原IX材料属性同等比例改变时，仅在表层观察到较低的细胞承载力变化（约13%，P<0.001），且沿侧向的距离增加时平均细胞承载力略有降低。
细胞体积的深度依赖性变化与细胞承载力趋势一致但强度较低。胶原VI属性增加30%时，表层和深层细胞体积变化显著增强约14%（P<0.001）。胶原VI属性降低30%时，细胞体积额外增加3.2%。胶原IX属性的改变对细胞体积影响甚微，且在移行层和深层产生统计学不显著的变化（P>0.05）。侧向上的形态学变化亦较小。
在峰值加载点且无任何材料属性改变时，软骨应力最大区域中，II型胶原承担最高应力（2.4 MPa），其次为VI型（0.52 MPa）和IX型（0.43 MPa）。各软骨基质（ECM、TM、PCM）承担的应力约为胶原平均值的十分之一。表层和上部随机层区的细胞在轴线对称附近应力更高（0.051 MPa）。胶原VI材料属性改变30%时，细胞应力分布和微环境发生显著变化：胶原VI属性降低导致PCM（从0.079 MPa升至0.09 MPa）和细胞（从0.051 MPa升至0.06 MPa）承担的应力显著增加。
细胞体积变化的基线预测与文献中已有原位测量和多尺度模拟结果具有可比性。在5%无约束压缩峰值加载下，模型预测软骨细胞体积变化范围为表层最大29.1%至深层最小5.12%，呈现随 cartilage 深度增加而递减的趋势。文献报告的原位压缩加载测量通常显示平均体积减小约5-15%，部分多尺度纤维增强多孔弹性模拟报告了更大的平均体积变化，同时捕捉了深度和位置依赖性趋势。
讨论部分，研究人员指出此前多种多尺度软骨细胞-软骨模型依赖于均质化、子模型或后处理策略来关联组织加载与细胞力学，而本研究采用显式耦合的3D细胞解析构建体，将解剖学细胞分布嵌入试样尺度无约束压缩模型中，使组织尺度反应力和细胞/PCM尺度力学能够在单一有限元框架内同步求解，从而实现对细胞微环境中胶原VI和IX网络扰动的系统研究。尽管预测聚合反应力趋向实验变异的上限且不完全与实验均值重合，此行为与宏观尺度主导反应力参数的不确定性一致；采用峰值力与平衡平均力的归一化比值这一几何无关指标进行比较时，模型产生的归一化峰值反应力与实验测量值相当，支持预测瞬态力响应的合理性。
全局敏感性分析结果强化了主要发现的解释：总体反应力方差由经典ECM决定因素主导，而细胞力方差主要由胶原VI及PCM/细胞属性控制，胶原IX贡献较小但非零的细胞尺度效应。这一量化排序支持了主要结论的稳健性，即在探索的参数范围内胶原VI比胶原IX对细胞微环境加载的影响更强。敏感性分析在缩减尺寸的3D构建体上进行以保证计算可行性，虽可能因几何效应影响绝对敏感性指标，但相对层级和数量级分离仍然具有参考价值。
胶原VI和IX属性改变均影响软骨聚合刚度，但效应存在显著差异：胶原VI改变产生显著的宏观力学响应变化（30%刚度增加导致峰值反应力约8%增加），而胶原IX改变对宏观反应影响甚微（同等幅度变化约2%增加）。这种差异部分归因于两种胶原在软骨中的相对丰度差异——胶原VI含量更高。已有假设认为IX型胶原的主要机械作用是载荷传递，而VI型胶原的主要作用是机械强化PCM从而为软骨细胞提供应力屏蔽。这些差异性功能角色也解释了两种胶原属性变化对组织聚合力学相对效应的不同。
软骨细胞的环向承载力在表层和中间区域较高，深层显著降低；侧向上随距对称轴距离增加而递减。尽管微胶原属性改变在完全加载与平衡加载实例之间的宏观反应差异消失，细胞承载力仍略有改变——这支持了软骨稳态加载可能无助于检测与微观改变相关的宏观反应的早期观察，尤其在细胞环境中。预测的细胞力可为理解生理加载条件下内部细胞力学水平提供参考，这些力学数据原则可用于原子力显微镜（atomic force microscope, AFM）纳米压痕实验。
正常软骨中预测的软骨细胞体积变化在峰值加载时平均约为8-26%，随深度递减，稳态时额外变化可忽略。这些数量级与已报告的原位研究（约1-29.3%，平均约15.3%）以及近期多尺度模拟结果相符。但需注意，本研究验证主要在组织聚合层面进行，当前构建体未针对完全匹配的成像/测试协议下的单细胞变形指标进行校准，因此细胞尺度结果的定量解释应谨慎。
研究强调，当前构建体将软骨细胞视为孔隙-超弹性连续体，假设细胞-PCM界面处渗透性/通量连续；未引入额外的半透膜水力阻力、渗透压差或膜张力，也未表征主动离子通道介导的体积调节。因此，预测体积变化应被解释为耦合细胞-PCM-ECM系统的有效孔隙力学结果，而非完全解析的力学-渗透响应。渗透效应和膜层面传输调控可影响细胞体积变化的动力学和绝对幅度；因此，预测体积变化的定量解释应保守，主要关注相对趋势。
胶原VI属性增加30%显著增强细胞体积变化（表层和深层约14%，P<0.001），这种适度的细胞变形可能源于PCM对细胞的屏蔽作用。胶原IX的改变对细胞体积变化影响预期较低，这与其较低的体积分数以及与软骨细胞的非直接联系相符。这些结果证实了PCM在调控软骨细胞力学响应中的重要作用。
虽然胶原VI和IX的扰动在无约束压缩下仅产生适度的聚合反应力变化，但相同扰动在软骨细胞力学环境中产生了更大的变化。具体而言，胶原VI硬化降低了平均环向细胞承载力并减少了相关细胞体积变化，而胶原IX扰动对表层细胞力和体积变化产生较小但可测量的效应。从机制上看，由于胶原VI和IX集中于作为ECM与细胞之间力学界面或"过滤器"的PCM和TM中，改变其刚度会在PCM/TM与软骨细胞之间重新分配应力，而不会显著改变由II型胶原网络主导的整个组织尺度承载系统。
这些发现应在所探索的加载模式和参数空间背景下进行解读，并受当前本构表征的制约——其中胶原IX被建模为与胶原VI共享功能形式的独立拉伸纤维网络。鉴于胶原IX生物学上属于具有重要纤维相关/交联作用的FACIT（fibril-associated collagen with interrupted triple helices）胶原，其对网络连通性、纤维间载荷传递和损伤耐受性的贡献在当前实现中未显式捕捉。在此边界条件下，胶原VI因其直接定位于PCM内而对细胞尺度力学环境施加更显著的影响；胶原IX则更适合被解释为上下文依赖性的载荷传递调节因素，其贡献可能因加载模式、空间分布和疾病介导的周围ECM/PCM变化而异。
由于孔隙-超弹性预测本质上具有速率依赖性——纤维弹性支撑与流体压力支撑之间的分配随加载速率变化——本研究报道的胶原VI和IX的差异性作用应被解读为特定于相对缓慢的斜坡-保持压缩速率（0.001 s
-1）。在更快、更具生理代表性的加载速率下，瞬态流体压力和纤维网络参与预计将发挥更大作用，可能放大纤维网络参数对聚合和细胞尺度响应的影响，并可能修改（不一定逆转）胶原VI与IX贡献的相对排名。
研究结论部分指出：研究人员使用显式孔隙-超弹性多尺度有限元软骨模型，研究了关节软骨关键胶原VI和IX组成成分变化对软骨细胞及聚合软骨力学的影响。在当前的胶原VI和IX拉伸纤维表征框架内，理论研究表明胶原VI和IX行为与细胞力学（包括细胞加载/变形及其周围微环境，主要是PCM的力学变化）之间存在有意义的关联。由于胶原IX作为FACIT胶原的交联功能在此未被显式捕捉，其在当前结果中的调节性而非主导性作用应被解读为受建模假设制约，并需要未来专门研究的验证。结果证明了当前构建体捕捉软骨细胞环境力学意义的能力，有助于理解结构组成变化对软骨维持和完整性的影响。该模型是检验组织层面加载、局部细胞膜力学和影响Piezo等力学敏感离子通道受体激活因素的机械影响的初始步骤，有助于识别软骨疾病的治疗靶点。
