LSM7协调scaRNA介导的snRNA修饰以确保剪接体保真度及精原干细胞分化

《Cell Death & Differentiation》：LSM7 coordinates scaRNA-mediated snRNA modification to ensure spliceosome fidelity and spermatogonial stem cell differentiation

　　

精子发生需要由主要剪接体（含U1、U2、U4/U6/U5 small nuclear ribonucleoproteins，snRNPs）与次要剪接体（含U11、U12、U4atac/U6atac/U5 snRNPs）共同精确调控的RNA剪接时空机制，但二者在生殖细胞发育中的功能仍不明确。研究人员阐明LSM蛋白家族成员LSM7作为LSM2-8复合物组分，在snRNP生物发生与精子发生过程中的核心功能。结果表明，LSM7维持Cajal体中U6 small nuclear RNA（snRNA）的稳定性，并直接与scaRNA2、scaRNA13、scaRNA17相互作用，调控U2与U12 snRNA的2′-O-甲基化（2′-O-methylation，2′-O-Me）与假尿苷化（pseudouridylation，Ψ）修饰。LSM7缺失导致U2、U5、U6 snRNA核定位缺陷与稳定性下降，对应snRNP复合物不稳定，并引发可变剪接异常，尤其影响互斥外显子（mutually exclusive exons，MXE）与外显子跳跃（exon skipping，SE）事件。这些剪接缺陷导致翻译调控紊乱，最终阻碍精原干细胞向精原细胞的分化。本研究确定LSM7是连接scaRNA指导的snRNA修饰、剪接体保真度与精原干细胞命运决定的关键调控因子，为雄性生殖细胞发育的转录后调控提供了重要机制见解。

论文解读：《LSM7协调scaRNA介导的snRNA修饰以确保剪接体保真度及精原干细胞分化》

研究背景与意义

精子发生是精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）向成熟精子连续分化的过程，依赖转录与转录后调控的精准协同。剪接体由主要剪接体（major spliceosome，含U1、U2、U4/U6/U5 snRNPs）与次要剪接体（minor spliceosome，处理占比约0.5%的AU-AC型内含子，含U11、U12、U4atac/U6atac/U5 snRNPs）组成，其snRNA的位点特异性修饰由Cajal体特异性小核仁RNA（small Cajal-body-specific RNAs，scaRNAs）引导，可增强snRNA稳定性与催化活性。LSM蛋白家族形成LSM1-7（胞质mRNA降解）与LSM2-8（核内结合U6 snRNA 3′端尿苷酸序列）两类异七聚体复合物，其中LSM7对维持LSM2-8复合物完整性至关重要，人类LSM7双等位基因变异可导致神经发育障碍，但其在精子发生中的功能尚未见报道。该研究旨在解析LSM7在生殖细胞发育中调控snRNP生物发生的分子机制，填补scaRNA在精子发生中生理功能的空白。

主要关键技术方法

研究采用小鼠遗传学模型，构建精原细胞特异性条件性敲除（conditional knockout，cKO）小鼠（Lsm7^fl/-;Stra8-Cre），以同窝野生型（wild type，WT）为对照。通过转录组测序（RNA sequencing，RNA-seq）与可变剪接分析解析转录动态，结合免疫沉淀偶联质谱（immunoprecipitation-mass spectrometry，IP-MS）、RNA免疫沉淀测序（RNA immunoprecipitation sequencing，RIP-seq）鉴定互作蛋白与RNA靶点。采用低dNTP反转录PCR（reverse transcription at low deoxy-ribonucleoside triphosphate concentrations followed by polymerase chain reaction，RTL-PCR）检测2′-O-Me修饰，N-环己基-N′-(2-吗啉乙基)碳二亚胺依赖性定量PCR（N-cyclohexyl-N′-(2-morpholinoethyl) carbodiimide-dependent quantitative PCR，CMC-qPCR）检测Ψ修饰，并通过免疫荧光、染色体铺展、TUNEL凋亡检测等分析表型。

研究结果

LSM7在精子发生全程的生殖细胞中表达

LSM7在出生后第8天（postnatal day 8，P8）起睾丸中表达逐渐升高，P28达峰值，富集于分选的生殖细胞组分，与生殖细胞标记MVH共定位，而在支持细胞（Sertoli cells，SCs）中几乎不表达，提示其功能集中于生殖细胞。

Lsm7敲除导致雄性不育与精子发生异常

Lsm7-cKO雄性完全不育，睾丸显著缩小，生精小管呈支持细胞仅存（Sertoli Cells-Only，SCO）表型，无成熟精子生成。P7起生殖细胞数量显著减少，P4起生精小管凋亡细胞增多，P10达峰值，表明LSM7缺失导致生精细胞在减数分裂前大量凋亡。

Lsm7敲除损害精原干细胞向精原细胞的转变

cKO小鼠减数分裂启动标记STRA8阳性细胞显著减少，联会复合体蛋白SYCP3与DNA损伤标记γH2AX双阳性细胞极少，未分化精原细胞标记PLZF阳性细胞增多，分化精原细胞标记c-KIT阳性细胞显著减少，证实LSM7缺失阻滞SSCs向分化精原细胞的过渡。

Lsm7条件性敲除导致减数分裂前期异常与生殖细胞减少

cKO雄性减数分裂前期精母细胞存在广泛γH2AX信号与联会异常，雌性cKO小鼠卵巢中卵母细胞P1显著减少、P5近完全耗竭，E17.5卵母细胞同样存在DNA损伤与联会缺陷，导致完全不育。

Lsm7敲除引起转录组谱异常

P4时cKO睾丸中同源染色体分离相关转录本下调，蛋白酶体负调控相关转录本上调；P7时差异表达转录本进一步增加，正常P4至P7下调的胶原基质相关转录本异常上调，上调的减数分裂周期相关转录本异常下调，转录重编程紊乱。

Lsm7缺失破坏雄性生殖细胞可变剪接

cKO睾丸中共鉴定2590（P4）与3305（P7）个异常剪接事件，其中互斥外显子（MXE）占比最高（54%与60%）。差异MXE事件富集于DNA损伤响应、细胞周期调控通路，如Sycp2、Six6os1等基因剪接异常，且与对应转录本下调显著重叠。蛋白质组学显示459个MXE异常基因蛋白表达降低，富集于RNA剪接与核糖体生物发生；410个基因蛋白表达升高，富集于染色体分离。

LSM7与睾丸中剪接体组分物理互作

IP-MS鉴定到391个LSM7互作蛋白，富集于RNA剪接通路，包括COILIN、U6 snRNP、hnRNP家族、PRP家族等剪接体组分，Co-IP验证了LSM7与hnRNPL、SRSF10、PTBP1的相互作用，免疫荧光证实二者在睾丸组织中共定位。

LSM7促进U6、U2、U5 snRNA在Cajal体的稳定性与定位

RIP-seq显示LSM7结合1274个基因的RNA，显著富集scaRNA2、scaRNA6、scaRNA9、scaRNA13、scaRNA17。LSM7与Cajal体标记COILIN共定位，Lsm7敲低导致GC-1精原细胞中U2、U5、U6、U12 snRNA转录水平下降，且从细胞核错误定位至细胞质。

LSM7支架结合scaRNA以促进U2与U12 snRNA的2′-O-Me和Ψ修饰

Lsm7敲低导致scaRNA转录水平下降，RTL-PCR显示U2 Cm⁶¹与U12 Gm²²的2′-O-Me修饰消失，敲低scaRNA2或scaRNA17导致U2、U12 snRNA核定位缺陷；CMC-qPCR显示Lsm7敲低选择性消除U2 Uψ⁵⁴的Ψ修饰，敲低scaRNA13同样导致U2 snRNA核输出异常。

讨论与结论

该研究首次阐明LSM7通过双重机制调控SSC分化：核内直接与剪接因子互作调控pre-mRNA剪接，Cajal体内作为支架维持scaRNA稳定性，介导U2与U12 snRNA的2′-O-Me与Ψ修饰，保障snRNP组装与剪接体保真度。LSM7缺失导致MXE剪接偏好性紊乱，影响DNA损伤响应与细胞周期基因，最终阻断生殖细胞发育。研究将Cajal体功能、scaRNA表观转录组调控与生殖系剪接体稳态直接关联，提出LSM7及其互作分子（scaRNA、snRNA、剪接因子）可作为非梗阻性无精子症与早发性卵巢功能不全的分子诊断候选靶点，为理解生殖失败机制与生育力保存策略提供了新框架。论文发表于《Cell Death & Differentiation》。