CsMYB6响应JA信号促进藏红花中藏红花素生物合成

《Journal of Plant Physiology》：CsMYB6 promotes crocins biosynthesis in response to JA signaling in Crocus sativus L.

　　

藏红花素已被鉴定为藏红花中的关键生物活性化合物。植物激素茉莉酸甲酯（MeJA）促进藏红花中藏红花素的积累，但其调控机制尚不清楚。MYB转录因子对调节植物发育和代谢过程至关重要。本研究中，研究人员鉴定了一个响应MeJA的R2R3-MYB转录因子CsMYB6。CsMYB6的表达与藏红花素生物合成关键基因的表达呈强相关性。在藏红花柱头中过表达CsMYB6可提高藏红花素含量，并上调藏红花素生物合成关键酶基因的表达水平。酵母单杂交（Yeast one-hybrid）实验证实了CsMYB6与CsZ-ISO3/CsCCD2启动子之间的相互作用。双荧光素酶（Dual-LUC）实验表明，CsMYB6可结合并激活CsZ-ISO3/CsCCD2的启动子。这些发现揭示了CsMYB6在MeJA介导的藏红花素生物合成中的新调控作用，并提出了"MeJA-CsMYB6-CsZ-ISO3/CsCCD2-藏红花素"调控模型，丰富了藏红花素生物合成的调控网络，为进一步探索藏红花次生代谢的分子机制奠定了基础。

**研究背景与意义**

藏红花（Crocus sativus L.）的干燥柱头是一种传统中药材，现代药理学研究已证明其在预防心血管疾病、治疗阿尔茨海默病、抗癌及抗抑郁等方面的功效。此外，藏红花还广泛应用于食品、化妆品和染料等工业领域。由于其显著的药用和经济价值，加之产量低、长期稀缺，提高藏红花中生物活性成分含量已成为关键挑战。

藏红花的主要活性成分包括藏红花酸（crocetin）、藏红花素（crocins）、苦藏红花素（picrocrocin）和藏红花醛（safranal），其中藏红花素是评价藏红花药材质量的关键指标。藏红花素是由藏红花酸与不同糖类结合形成的一系列水溶性类胡萝卜素酯，其中藏红花素I（crocin I）和藏红花素II（crocin II）的含量是藏红花质量评价的关键指标。藏红花素源自类胡萝卜素生物合成途径，可分为三个阶段：上游部分通过甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）途径和甲羟戊酸（MVA）途径生成异戊烯基焦磷酸（IPP）及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），随后这两种化合物连接并经一系列酶催化反应产生香叶基香叶基二磷酸（GGPP），即藏红花素及其他萜类化合物的直接前体；中期对应类胡萝卜素代谢，GGPP参与二聚化形成第一种类胡萝卜素——八氢番茄红素，随后经一系列脱氢反应产生番茄红素，再通过环化、羟基化和环氧化反应形成α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素和玉米黄质等物质；下游部分主要是玉米黄质等化合物在类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCDs）、醛脱氢酶（ALDHs）和尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（UGTs）等酶的作用下转化为苦藏红花素和藏红花醛，苦藏红花素和藏红花醛在酶或热的作用下失去一分子葡萄糖并进一步脱水形成藏红花醛和藏红花素。

植物次生代谢产物的积累受多种植物激素调控，如水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）和茉莉酸甲酯（MeJA）等。MeJA尤其能刺激萜类化合物的产生。然而，MeJA诱导的MYB转录因子如何在藏红花次生代谢物生物合成中作为正调控因子发挥作用，目前知之甚少。

**研究目的**

研究人员观察到外源MeJA诱导导致藏红花中藏红花素含量增加，进而鉴定了响应MeJA并正向调控藏红花活性成分的转录因子CsMYB6，旨在阐明CsMYB6在MeJA诱导的藏红花素生物合成中的作用机制，为藏红花次生代谢的分子机制研究提供新见解。

**主要技术方法**

本研究以浙江农林大学栽培的藏红花为材料，采用100 μmol·L^-1 MeJA对藏红花柱头进行外源喷施处理，于处理后0、0.5、1、3、6、9和12小时采集样本进行基因表达分析，以水处理0小时样本为对照。研究运用了实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进行基因表达分析、高效液相色谱（HPLC）检测藏红花素含量、酵母单杂交（Y1H）验证蛋白-DNA相互作用，以及双荧光素酶（Dual-LUC）报告基因实验验证转录激活活性。

**研究结果**

**MeJA处理促进藏红花素积累**

为探究激素对藏红花素含量的影响，研究人员对藏红花柱头喷施100 μM MeJA。研究表明，外源MeJA的施加显著增强了藏红花活性成分的积累。与对照组相比，实验组藏红花素含量显著增加。具体而言，处理后12小时，藏红花素I含量增加了2.42%；处理后24小时，增加了2.57%。这一结果表明MeJA有效促进了藏红花素的生物合成。

**CsMYB6的鉴定与表达分析**

研究人员鉴定了一个响应MeJA的R2R3-MYB转录因子CsMYB6。CsMYB6的表达与藏红花素生物合成关键基因的表达呈现强相关性，提示CsMYB6可能参与调控藏红花素的生物合成过程。

**CsMYB6过表达促进藏红花素积累**

通过在藏红花柱头中瞬时过表达CsMYB6，研究人员发现CsMYB6能够促进藏红花素的积累，同时增强藏红花素生物合成途径中关键酶基因的表达。这一结果证实了CsMYB6在藏红花素生物合成中的正调控作用。

**CsMYB6与下游靶基因的相互作用**

酵母单杂交实验证实CsMYB6与CsZ-ISO3和CsCCD2的启动子存在相互作用。双荧光素酶实验进一步证明，CsMYB6能够结合并激活CsZ-ISO3和CsCCD2的启动子，从而促进下游基因的表达，推动藏红花素的生物合成。CsZ-ISO3编码ζ-胡萝卜素异构酶（zeta-carotene isomerase），参与类胡萝卜素生物合成途径；CsCCD2编码类胡萝卜素裂解双加氧酶2（carotenoid cleavage dioxygenase 2），是藏红花素生物合成下游途径的关键酶。

**讨论**

本研究阐明了CsMYB6在MeJA诱导的藏红花素生物合成中的作用，将CsMYB6定位为研究藏红花次生代谢的有前景候选因子，为藏红花次生代谢分子机制的未来研究奠定了基础。研究提出的"MeJA-CsMYB6-CsZ-ISO3/CsCCD2-藏红花素"调控模型，丰富了藏红花素生物合成的调控网络，为深入理解藏花红次生代谢的分子调控机制提供了新视角。

**研究结论**

本研究鉴定并功能分析了一个响应JA的CsMYB6基因，该基因与藏红花中藏红花素I和藏红花素II的生物合成呈现强相关性。通过在藏红花柱头中的瞬时过表达，研究证实了CsMYB6在藏红花素生物合成中的正调控作用，突出强调了其与藏红花素生物合成途径关键酶基因CsZ-ISO3和CsCCD2启动子元件的结合，进而激活下游基因表达的功能。该发现发表在《Journal of Plant Physiology》上。