细胞器靶向光敏剂负载纳米盘用于增强肿瘤光免疫治疗

《Aggregate》：Organelle-Targeted Photosensitizer-Loaded Nanodiscs for Improved Tumor Photoimmunotherapy

　　

光动力治疗（photodynamic therapy，PDT）是一种前景良好的癌症治疗策略，具有微创性和高选择性，但其疗效在很大程度上依赖于亚细胞水平活性氧（reactive oxygen species，ROS）的定位。尽管细胞器靶向PDT能够增强抗肿瘤效应，但关于其光细胞毒性以及光免疫激活能力的系统性评估与比较仍然缺乏。研究人员以脱镁叶绿酸-a（pyropheophorbide a，Ppa）为核心骨架，合成了4种细胞器靶向光敏剂（photosensitizers，PSs）：分别靶向线粒体的Ppa-Mit、靶向溶酶体的Ppa-Lys、靶向内质网的Ppa-ER以及靶向细胞核的Ppa-Nuc。随后，这些PS分别被包封入合成高密度脂蛋白（synthetic high-density lipoprotein，sHDL）纳米盘中，形成PMN、PLN、PEN和PNN。所有纳米盘均实现了特异性的细胞器靶向。其光细胞毒性强弱顺序为PLN > PMN > PNN > PEN，而PMN通过诱导强烈的损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）分泌，表现出最佳的免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD）诱导能力。在体内，PMN和PLN均实现了肿瘤的完全清除且无复发，并促进成熟树突状细胞（dendritic cells，DCs）以及表达Granzyme B的细胞毒性CD8⁺ T细胞浸润，从而诱导强效抗肿瘤免疫。该研究确定PMN和PLN为有前景的PDT制剂，并强调线粒体靶向与溶酶体靶向PDT是实现高效肿瘤光免疫治疗的优选策略，为靶向PS的理性设计提供了指导。

该论文发表于《Aggregate》，围绕“亚细胞定位决定光动力治疗（photodynamic therapy，PDT）效应”这一核心问题展开，系统比较了不同细胞器靶向光敏剂在肿瘤光免疫治疗中的作用差异。研究背景在于：PDT具有微创、高选择性和低毒性等优势，但其疗效高度依赖光敏剂（photosensitizer，PS）产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）的位置。由于ROS寿命极短、扩散半径极小，PS所处亚细胞区室直接决定损伤对象及后续细胞命运。既往研究虽已证明细胞器靶向PDT优于非靶向PDT，但在同一母体光敏剂框架下，对线粒体、溶酶体、内质网和细胞核等不同细胞器靶向策略的光细胞毒性与免疫激活能力尚缺乏系统平行比较。因此，有必要开展该研究，以明确更优的靶向区室，并为靶向PS优化提供可推广的设计依据。

研究人员以脱镁叶绿酸-a（pyropheophorbide a，Ppa）为核心，分别构建了线粒体靶向Ppa-Mit、溶酶体靶向Ppa-Lys、内质网靶向Ppa-ER和细胞核靶向Ppa-Nuc，并将其分别封装于合成高密度脂蛋白（synthetic high-density lipoprotein，sHDL）纳米盘中，得到PMN、PLN、PEN和PNN。研究系统评估了这些制剂的理化性质、细胞摄取、亚细胞定位、胞内ROS生成、光细胞毒性、免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD）诱导能力及体内抗肿瘤和免疫激活效果。结果显示，尽管4种纳米盘均可实现预期细胞器靶向，但其细胞摄取和生物学效应存在显著差异。总体上，PLN具有最强光细胞毒性，PMN则表现出最强综合ICD诱导能力；在动物体内，PMN和PLN均可实现肿瘤完全清除且无复发，并诱导更强的成熟树突状细胞（dendritic cells，DCs）及细胞毒性CD8⁺ T细胞浸润。研究的重要意义在于，不仅筛选出PMN和PLN这两类有前景的PDT候选制剂，还进一步指出线粒体靶向与溶酶体靶向PDT是更有利于肿瘤光免疫治疗的策略。

本研究采用的关键技术方法主要包括：通过酰胺化偶联合成4种细胞器靶向Ppa衍生物，并以薄膜水化法制备PS负载sHDL纳米盘；利用透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）表征纳米盘形貌与粒径；以流式细胞术、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、ABDA和DCFH-DA探针、CCK-8及凋亡分析评估细胞摄取、亚细胞定位、ROS生成和光毒效应；通过CRT暴露、ATP释放、HMGB1与HSP70分泌检测ICD；体内实验采用皮下KPC胰腺肿瘤小鼠模型进行荧光成像、疗效评价、TUNEL及肿瘤免疫浸润流式分析。

2.1 Preparation and Characterization
研究人员首先通过Ppa与带有氨基功能化细胞器特异性配体的酰胺化偶联，获得4种细胞器靶向PS。结果表明，各衍生物的最大吸收峰均位于669 nm、最大发射峰位于677 nm，说明靶向配体修饰未改变Ppa的光学性质。进一步经薄膜水化法制备PS负载sHDL纳米盘。TEM显示PMN、PLN、PEN和PNN均呈均一盘状结构，DLS显示粒径约10–15 nm，包封率均在90%以上，提示该递送体系具有良好构建质量和高度一致性。

2.2 Cellular Uptake of PMN, PLN, PNN, and PEN
在相同载体平台条件下，研究人员比较了不同纳米盘的细胞摄取差异。流式结果显示，4种制剂在0.5–4 h内胞内浓度均随时间增加，但PMN和PLN的摄取效率显著高于PEN和PNN。文中据实验结果总结认为，这种差异主要与载荷PS进入细胞后的胞内命运有关：Ppa-Lys进入内吞-溶酶体系统后可直接滞留于溶酶体，Ppa-Mit则更易逃逸入胞质并在负线粒体膜电位驱动下富集于线粒体；相比之下，PEN和PNN更容易发生内体滞留、荧光淬灭或降解，从而导致表观摄取较低。

2.3 Intracellular Localization of Organelle-Targeted PSs
为验证靶向准确性，研究人员采用CLSM观察胞内定位。PMN与线粒体探针显示较强共定位，Pearson相关系数为0.75；PLN与溶酶体探针共定位最显著，Pearson相关系数为0.89；PEN与内质网探针共定位良好，Pearson相关系数为0.68；PNN则主要分布于细胞核区域，与PI信号高度重叠，Pearson相关系数为0.82。该部分结果说明，4种PS经纳米盘递送后均能有效到达预定细胞器，为后续比较不同亚细胞位点PDT效应奠定基础。

2.4 Evaluation of the Intracellular ROS
在无细胞体系中，ABDA检测表明4种纳米盘在相同照射条件下均能有效产生活性单线态氧，且总体产氧能力无显著差异。进入细胞后，DCFH-DA检测显示所有PS负载纳米盘在光照下均能产生ROS，而空白纳米盘无此效应。PMN诱导的胞内ROS水平最高，约为PLN的1.2倍、PEN的1.4倍和PNN的1.6倍。研究表明，这种差异并非主要源于溶液状态下固有产氧能力差异，而更可能与不同制剂的细胞摄取效率及亚细胞定位特征有关。

2.5 Photocytotoxicity of PMN, PLN, PEN, and PNN
CCK-8结果显示，4种PS负载纳米盘在暗条件下总体毒性较低，说明体系具有良好生物相容性。光照后，PLN表现出最强细胞毒性，半数抑制浓度（IC₅₀）为0.291 μM；PMN次之，IC₅₀为0.351 μM；PNN和PEN分别为0.821 μM和1.079 μM。据此，光细胞毒性强弱顺序为PLN > PMN > PNN > PEN。该结果提示，尽管PMN具有更高摄取和更强胞内ROS生成，但溶酶体定位ROS对增强光细胞毒性更为显著。流式凋亡分析进一步显示，PMN和PLN诱导超过60%的细胞凋亡，而PNN和PEN不足30%，说明这些制剂主要通过诱导凋亡发挥杀伤作用。

2.6 ICD Mediated by PMN, PLN, PNN, and PEN
研究人员进一步比较各制剂诱导ICD的能力。CRT（钙网蛋白，calreticulin）暴露检测显示，光照后PMN、PLN和PEN诱导的CRT外翻水平相近，且均明显高于PNN，提示内质网相关损伤对CRT暴露尤为关键。ATP分泌检测表明，PMN和PLN诱导ATP释放最强，均超过70 nM，明显高于PNN和PEN约40 nM的水平，说明线粒体靶向和溶酶体靶向更有利于“find-me”信号释放。进一步检测高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和热休克蛋白70（HSP70）发现，PMN组分泌趋势最高，PLN、PNN和PEN相对较低或接近。综合不同损伤相关分子模式（DAMPs）输出谱可知，不同细胞器靶向策略对ICD的调控具有特异性：内质网靶向更利于CRT外翻，而线粒体与溶酶体靶向更利于ATP分泌；总体而言，线粒体靶向PDT所触发的ICD相关信号最强。

2.7 In Vivo Antitumor Efficacy of Photoimmunotherapy
在皮下KPC肿瘤模型中，体内荧光成像显示PMN、PLN、PNN和PEN均可在静脉注射后逐步富集于肿瘤，24 h离体分析表明4组肿瘤蓄积无明显差异，说明体内递送基础条件总体相当。疗效评估显示，治疗后第16天，PMN和PLN组肿瘤均被完全清除且无复发；PNN和PEN虽在早期抑瘤明显，但后期出现复发。生存分析同样支持这一结果：对照组小鼠于第24天全部死亡，PNN和PEN组在第36天已有死亡，而PMN和PLN组在40天观察期末均无死亡。TUNEL结果表明所有PS负载纳米盘均可诱导肿瘤细胞凋亡，其中PMN和PLN略强于PEN和PNN。

在肿瘤免疫微环境方面，流式细胞术显示，所有治疗组均可提高肿瘤内成熟DC（CD11c⁺CD80⁺CD86⁺）比例，但PMN和PLN升高更显著。与此同时，PMN和PLN组肿瘤浸润CD8⁺ T细胞数量更高，Granzyme B⁺ CD8⁺ T细胞比例也更高，说明其能够更有效激活细胞毒性免疫应答。该部分结果表明，优异的体内疗效不仅依赖直接光毒作用，也与更强的ICD诱导和后续适应性免疫激活密切相关。安全性方面，健康小鼠主要脏器H&E染色未见明显炎症、凋亡或坏死，提示这些纳米盘具有良好体内相容性。

从讨论内容可以归纳出，本研究最重要的发现是：不同细胞器靶向并非仅改变PS定位，而是会系统性影响细胞摄取、胞内ROS生成、光细胞毒性模式以及DAMPs释放谱，从而决定最终光免疫治疗效能。溶酶体靶向PLN在直接光细胞毒性方面最强，线粒体靶向PMN则在综合ICD信号输出和免疫激活方面最优，二者在体内均实现完全、无复发的肿瘤清除。相比之下，内质网靶向PEN虽然有利于CRT暴露，但总体疗效不及PMN和PLN；细胞核靶向PNN则处于中间水平。由此可见，线粒体和溶酶体是更适合用于肿瘤光免疫治疗的亚细胞靶点。

结论部分可译为：
总之，本研究以脱镁叶绿酸-a（pyropheophorbide a，Ppa）为核心基元，设计并合成了一系列细胞器靶向光敏剂（photosensitizers，PSs），并分别制备了负载这些细胞器靶向PS的仿生脂质纳米盘。研究人员系统考察并比较了这些纳米盘在体外和体内的光动力及光免疫活性。结果证实，包封于纳米盘中的所有细胞器靶向PS均可高效富集于特定目标细胞器。然而，这些细胞器靶向PS的细胞摄取效率存在显著差异，其中PMN和PLN明显高于PEN和PNN。其光细胞毒性强弱顺序为PLN > PMN > PNN > PEN。对这些纳米盘体外诱导免疫原性细胞死亡（ICD）能力的评估表明，其损伤相关分子模式（DAMPs）分泌谱具有细胞器依赖性：PMN、PLN和PEN诱导的CRT暴露高于PNN，而PMN和PLN触发了更强的ATP分泌。上述结果提示，不同细胞器靶向策略会差异性调控不同DAMPs输出，其中线粒体靶向和溶酶体靶向PDT表现出更强的总体ICD相关信号。

对纳米盘体内抗肿瘤疗效的评估显示，PMN和PLN表现出更优异的抗肿瘤作用，实现了无复发的肿瘤完全清除，而PNN和PEN处理的肿瘤在后期出现复发。肿瘤组织免疫细胞浸润分析表明，所有PS负载纳米盘均可有效促进成熟DC和细胞毒性T细胞浸润，并诱导CD8⁺ T细胞表达Granzyme B，从而介导高效肿瘤抑制。与PEN和PNN相比，PMN和PLN诱导了更强的抗肿瘤免疫应答。本研究不仅确定了PMN和PLN是具有前景的肿瘤PDT制剂，也进一步强调线粒体靶向和溶酶体靶向PDT是肿瘤光免疫治疗的有利策略。