《Aging Cell》：Methionine Restriction Extends Yeast Lifespan by Activating Non-Nitrogen-Starvation-Induced Autophagy Through Limiting Methylation of Protein Phosphatase 2A
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甲硫氨酸限制（MR）能够延长多种真核生物的寿命和健康期，但其分子机制尚不清楚。本研究发现，MR延长酿酒酵母时序寿命（CLS）和复制寿命（RLS）的能力源于甲硫氨酸向甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转化减少。在机制上，MR下调的关键抗衰老事件是蛋白磷酸酶2A（
甲硫氨酸限制（MR）能够延长多种真核生物的寿命和健康期，但其分子机制尚不清楚。本研究发现，MR延长酿酒酵母时序寿命（CLS）和复制寿命（RLS）的能力源于甲硫氨酸向甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转化减少。在机制上，MR下调的关键抗衰老事件是蛋白磷酸酶2A（PP2A）的甲基化。在时序衰老细胞中，MR条件下未甲基化的PP2A不再使SEACIT复合体组分Npr2去磷酸化，从而导致非氮饥饿（NNS）诱导自噬的激活。编码SEACIT组分或ATG1（编码自噬起始的关键因子）基因的缺失阻断了MR延长寿命的能力，表明NNS诱导自噬通路在MR延长寿命中的关键作用。研究人员鉴定了PP2A去磷酸化的Npr2相关位点为丝氨酸362，并证明Npr2磷酸模拟突变体足以延长时序寿命和复制寿命。最后，研究人员发现仅在时序衰老早期进行MR就足以延长自噬并延长寿命。除阐明MR介导寿命延长的分子机制外，该研究还强调了在不需难以长期维持的MR饮食改变的情况下，实现人类寿命和健康期延长的潜在治疗靶点。
衰老研究正日益成为生命科学领域的核心议题。研究人员利用模式生物探寻细胞衰老的分子机制，其中酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）凭借其保守的衰老相关生物学通路而成为寿命研究的强大模型。该酵母不仅可用于研究模拟高等真核生物有丝分裂后细胞衰老的时序寿命（CLS），还可通过计算细胞分裂次数来研究有丝分裂衰老的复制寿命（RLS），后者是其他真核细胞无法精确测量的独特优势。
热量限制（CR）是延长寿命和健康期的有效手段，但最佳方案的选择受基因型和环境因素干扰，且其实施强度在实验室外难以实现，可能对人类产生不利影响。相比之下，降低蛋白质或单个氨基酸（如甲硫氨酸）摄入的饮食可在不减少热量摄入的情况下支持长寿，规避CR的潜在风险。研究表明，甲硫氨酸减少可能是CR延长寿命效应的原因，且MR不仅能延长多种生物的寿命，还能改善哺乳动物的血糖控制、增强代谢健康并减少脂肪肝疾病。然而，MR介导寿命延长的基本分子机制尚不清楚。此外，由于甲硫氨酸存在于所有蛋白质中，人类难以实现MR，这凸显了揭示MR诱导关键分子变化以发现抗衰老治疗靶点的重要性。
甲硫氨酸作为多肽合成起始氨基酸，其在蛋白质翻译中的作用至关重要，但其参与的其他细胞过程（如转化为SAM后的甲基化反应、多胺合成、转硫途径生成抗氧化代谢物等）是否对MR的延寿效应起关键作用尚不明确。先前研究发现MR可在酵母CLS期间诱导自噬，而自噬在多种模式生物的抗衰老中发挥重要作用。然而，MR如何在衰老过程中诱导自噬仍不清楚。
研究人员在《Aging Cell》发表的研究揭示了MR延长酵母寿命的分子机制：降低的甲硫氨酸水平导致SAM合成减少，进而降低PP2A甲基化水平；在CLS期间，未甲基化的PP2A无法使SEACIT复合体组分Npr2的丝氨酸362位点去磷酸化，从而激活NNS诱导自噬以延长时序寿命；MR还可通过类似机制延长RLS。
本研究主要采用酿酒酵母BY4741（met15?，用于MR的CLS研究）和BY4742菌株（S288C背景），通过同源重组、CRISPR-Cas9介导的基因组编辑构建突变体；运用GFP-Atg8自噬检测法评估自噬流；通过Western blot检测PP2A甲基化状态、Npr2磷酸化水平及组蛋白甲基化；采用LC-MS/MS分析组蛋白甲基化修饰；利用标准CLS和RLS实验测定寿命；并通过SAM/SAH补充实验、基因缺失及磷酸模拟突变体验证分子机制。
3.1 SAM而非SAH的补充阻止MR延长CLS：研究人员使用缺乏甲硫氨酸生物合成关键酶基因MET15的BY4741菌株模拟MR，发现SAM（400 μM）的补充可阻止MR延长CLS，而SAH（1 mM）不能，表明MR通过减少SAM而非SAH的产生来促进CLS延长，且该机制与蛋白质合成减少无关。
3.2 MR不减少组蛋白甲基化：LC-MS/MS分析显示，与时氮饥饿诱导的组蛋白去甲基化不同，MR在CLS第3天未显示组蛋白去甲基化，反而H3K36三甲基化水平升高，提示MR期间可能存在H3K36甲基转移酶或去甲基化酶的选择性调控，而非SAM可用性降低的全局效应。
3.3 MR激活NNS诱导自噬以延长寿命：GFP-Atg8检测显示，MR在CLS第3天诱导更高水平的自噬，并维持至第7和12天，而在对数生长期细胞（Day 0）中无此效应。SAM补充可减弱MR诱导的自噬。ATG1缺失阻断MR诱导自噬并显著减少CLS延长。tor1?与MR存在上位效应关系，SAM补充可部分减少其CLS延长。研究人员进一步验证，Npr2及SEACIT复合体其他组分（Npr3、Iml1）的缺失均阻止MR延长CLS，且Npr2参与Day 3的瞬时自噬激活。MR诱导的自噬水平低于雷帕霉素处理，且不抑制Tor1活性。
3.4 RLS的延长依赖于MR酵母中的自噬：MET15缺失未延长RLS，但完全阻断甲硫氨酸生物合成的MET2缺失可延长RLS。SAM补充完全消除MR的RLS延长效应。ATG1缺失阻止MR延长RLS，Npr2亦为MR延长RLS所必需，表明NNS诱导自噬也参与RLS延长。
3.5 MR期间PP2A甲基化降低：Western blot检测显示，MR导致PP2A甲基化水平较未进入CLS的对照降低，而PP2A甲基转移酶PPM1缺失导致更大幅度的甲基化降低。SAM补充可阻断MR引起的PP2A甲基化减少。值得注意的是，PPM1缺失本身不延长CLS且阻止MR介导的寿命延长，提示MR建立了有利于Npr2磷酸化但避免完全去甲基化有害脱靶效应的"有益设定点"。
3.6 MR以SAM依赖性方式增加NNS诱导自噬调节因子Npr2的磷酸化：MR在CLS第3、7和12天增加Npr2磷酸化，但Day 0细胞无此现象。PP2A的β亚基Rts1（而非Cdc55）为Npr2去磷酸化所必需。SAM补充可降低MR期间的Npr2磷酸化至对照水平。
3.7 MR通过Npr2磷酸化延长CLS而非RLS：质谱分析鉴定Npr2的S362为磷酸化位点。S362E和S362D磷酸模拟突变体可持续诱导CLS期间的自噬流，并足以延长CLS（即使存在SAM补充）和RLS。不可磷酸化突变体S362A阻止MR诱导自噬及延长CLS，但未能阻止MR延长RLS，表明MR通过不同机制延长RLS。
3.8 仅CLS初期的MR足以延长寿命：研究人员在第0、4、7、9或11天向MR培养物中添加甲硫氨酸以终止MR。第0和4天添加阻止寿命延长，第7天添加仍有部分延长，第9和11天添加则实现完全延长。自噬可持续至第17天（无论MR持续与否），而Day 4添加甲硫氨酸则阻止自噬持续诱导。早期MR后，PP2A甲基化和Npr2磷酸化在后期可恢复，但自噬和寿命延长效应持续存在，提示酵母细胞具有"自噬记忆"。
讨论与结论：本研究揭示了MR延长酿酒酵母寿命的分子机制：MR降低甲基供体SAM水平，减少PP2A甲基化；在时序衰老过程中，未甲基化的PP2A无法使Npr2去磷酸化，从而激活NNS诱导自噬，延长寿命。仅早期MR足以激活持续自噬并延长寿命。
MR仅在时序衰老期间（而非正常生长期间）激活NNS诱导自噬，这需要除了PP2A去甲基化之外的额外衰老相关事件协同。研究人员推测，进入CLS时某激酶（可能为酪蛋白激酶1或2）诱导Npr2磷酸化，而MR条件下未甲基化PP2A/Rts1无法有效去磷酸化Npr2，从而维持Npr2-Npr3-Iml1复合体形成和NNS诱导自噬。
MR延长RLS需要更严格的限制，其机制与CLS类似但不完全相同：虽然Npr2和自噬为RLS延长所必需，但Npr2 S362磷酸化并非RLS延长的必需环节，提示存在其他机制。
早期MR足以延长CLS的发现具有重要转化意义：这提示存在"长寿记忆"现象，即早期营养干预可建立持续的应激抵抗能力。该发现表明营养时机（而非仅组成）可能优化人类健康期，短期饮食调整在特定生命阶段可能激活类似终身限制的自噬和应激反应通路。基于MR在酵母中的分子机制，未来可探索促进人类健康期的新型干预措施，并确定优化益处的时效窗口。
