RORA靶向PRNP通过激活氧化损伤诱导的晶状体上皮细胞衰老和凋亡调控年龄相关性白内障（ARC）

《Aging Cell》：RORA Targeting PRNP Modulates Age-Related Cataract via Activation Oxidative Injury-Induced Cellular Senescence and Apoptosis of Lens Epithelial Cells

　　

年龄相关性白内障（ARC）是一种严重的视力损害性疾病，主要由氧化应激诱导的晶状体上皮细胞（LECs）衰老和凋亡引起。本研究建立了亚硒酸钠（Na2SeO3）诱导的新生大鼠氧化应激白内障模型，以模拟ARC的病理进程。研究人员发现，视黄酸受体相关孤儿受体α（RORA）通过靶向朊蛋白（PRNP）加剧细胞衰老和氧化损伤，其小分子抑制剂SR3335在调控ARC进展中显示出治疗潜力。体外实验表明，抑制RORA显著缓解细胞衰老，增强LECs的抗凋亡能力，并提高其抗氧化应激能力，而激活RORA则产生相反的效果。体内实验证明，玻璃体腔内注射重组PRNP蛋白能够消除RORA沉默的保护作用，从而加剧ARC的进展。在机制层面，RNA测序（RNA-seq）和双荧光素酶报告实验揭示RORA结合其下游靶基因PRNP。RORA靶向PRNP调控p53/p21/Bax信号通路，从而抑制细胞衰老和凋亡。这些发现强调了转录因子RORA在ARC发展中对LECs氧化应激损伤、凋亡和衰老调节的关键作用。鉴定PRNP作为RORAs的下游靶点可能为ARC治疗提供一种新型的双靶点策略。

该研究发表于《Aging Cell》，聚焦于年龄相关性白内障（ARC）这一全球主要的可逆性视力丧失病因。目前临床治疗ARC主要依靠手术，但随着全球老龄化加速，从源头预防白内障晶状体形成以避免术后并发症（如屈光误差和后囊膜混浊）成为重要方向。ARC的核心病理机制被认为是氧化应激导致的晶状体上皮细胞（LECs）衰老与凋亡，然而涉及的关键转录调控网络尚未完全阐明。研究人员开展了一系列体内外实验，旨在探究视黄酸受体相关孤儿受体α（RORA，一种核受体超家族转录因子）在ARC中的作用及其下游机制。研究发现，RORA在ARC患者前囊膜组织、氧化损伤细胞模型及白内障大鼠模型中均显著上调；抑制RORA能减轻LECs的氧化应激、衰老与凋亡，并缓解大鼠白内障进展，而激活RORA则加重病理表型；机制上，RORA直接结合并转录激活PRNP（朊蛋白基因），PRNP过表达或重组蛋白回补可逆转RORA抑制的保护效应，该过程通过调控p53/p21/Bax信号通路实现。该研究的重要意义在于首次揭示了RORA-PRNP轴在ARC中的促病作用，为ARC提供了潜在的药物治疗新靶点（如RORA抑制剂SR3335）及双靶点干预策略。

为开展研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：临床样本方面，收集了8例45-60岁ARC患者及5例年龄匹配正常对照的晶状体前囊膜组织；动物模型方面，构建了皮下注射亚硒酸钠（Na₂SeO₃）的SD新生大鼠ARC模型，并进行了腹腔注射RORA抑制剂SR3335及玻璃体腔注射重组PRNP蛋白的干预；细胞模型方面，使用人晶状体上皮细胞系SRA01/04，通过H₂O₂处理建立氧化应激模型，并进行RORA敲减（siRNA）与激活（SR1078）及PRNP过表达（慢病毒）操作；分子生物学与生化检测方面，运用了Western blot、RT-qPCR、RNA测序（RNA-seq）、双荧光素酶报告实验、活性氧（ROS）检测、丙二醛（MDA）与超氧化物歧化酶（SOD）活性测定、线粒体膜电位（JC-1）检测、细胞凋亡（Annexin V-FITC/PI）分析、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色、Edu增殖检测及组织学（H&E）分析等。

研究结果如下：

3.1 RORA在Na₂SeO₃诱导的白内障大鼠模型中上调。研究人员通过构建亚硒酸钠诱导的ARC大鼠模型，结合裂隙灯、光学相干断层扫描（OCT）、H&E染色及分子标志物检测，确认模型成功模拟了ARC的晶状体混浊、氧化损伤、细胞衰老与凋亡等病理特征；并发现ROR家族成员（尤其是RORA）的RNA和蛋白表达在模型晶状体组织中显著升高。

3.2 RORA在ARC晶状体前囊膜及H₂O₂诱导的LECs中上调。研究人员检测了ARC患者前囊膜组织，发现RORA mRNA表达显著升高；同时在H₂O₂处理的SRA01/04细胞中，证实了氧化应激、线粒体膜电位下降、凋亡率增加、衰老相关标志物（如P53、P21、p16、Lamin B1）表达异常及SA-β-Gal阳性细胞增多，且RORA蛋白表达在此细胞模型中同样上调。

3.3 敲减与激活RORA改变H₂O₂诱导的细胞衰老、凋亡及氧化损伤（体外）。研究人员在H₂O₂处理的LECs中进行RORA敲减（siRORA）与激活（SR1078），发现敲减RORA可降低ROS水平与MDA含量、提升SOD活性，减少凋亡与SA-β-Gal阳性细胞，改善线粒体膜电位及凋亡/衰老相关蛋白（Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase3、P53、P21、Lamin B1）表达；而激活RORA则产生相反的加重效应，表明RORA在氧化应激下促进LECs的损伤表型。

3.4 PRNP是RORA的下游靶点。研究人员对RORA敲减后的H₂O₂处理细胞进行RNA-seq，筛选出差异表达基因，并经RT-qPCR验证PRNP为显著下调的候选靶基因；进一步发现PRNP在ARC患者组织、细胞及大鼠模型中也上调，且RORA敲减降低PRNP蛋白表达、激活则升高；通过Cistrome数据浏览器与JASPAR数据库预测及双荧光素酶报告实验，证实RORA直接结合PRNP启动子区域并激活其转录。

3.5 PRNP过表达逆转RORA敲减诱导的LECs表型改变（体外）。研究人员在RORA敲减的H₂O₂处理LECs中过表达PRNP，发现其逆转了RORA敲减带来的ROS降低、抗氧化能力提升、凋亡与衰老减少及相应蛋白表达改善，表明PRNP介导了RORA的部分促损伤作用。

3.6 重组PRNP蛋白逆转RORA抑制在Na₂SeO₃诱导的白内障大鼠中的保护作用（体内）。研究人员在亚硒酸钠诱导的ARC大鼠中，联合使用SR3335（抑制RORA）与玻璃体腔注射重组PRNP蛋白，发现PRNP蛋白处理加剧了晶状体的混浊与光散射、恶化氧化应激与组织病理结构，逆转了SR3335降低的凋亡/衰老蛋白表达及SA-β-Gal阳性信号，证实PRNP是RORA体内促ARC的关键下游介质。

3.7 RORA靶向PRNP激活氧化损伤诱导的LECs衰老和凋亡的分子机制。研究人员总结前述结果，提出RORA通过靶向并转录激活PRNP，进而调控p53/p21/Bax信号通路，促进氧化损伤下LECs的衰老与凋亡，从而参与ARC发病的分子机制模式图。

在讨论部分，研究人员首先总结核心发现：RORA在氧化应激下的LECs、ARC患者组织及两种ARC模型中均上调，其功能缺失减轻而获得加重LECs衰老、凋亡与氧化损伤及体内白内障进展；机制上RORA直接转录激活PRNP，PRNP过表达/回补消除RORA抑制的保护作用，该过程涉及p53/p21/Bax通路。接着讨论ARC的研究背景与模型局限性：ARC是全球公共卫生挑战，LECs稳态维持对预防ARC至关重要，氧化应激（ROS过量与抗氧化防御受损）是其核心驱动；本研究使用的亚硒酸钠诱导新生大鼠模型虽为急性氧化应激模型，但能重现人ARC（尤其核性ARC）的关键特征（谷胱甘肽耗竭、细胞衰老、LECs凋亡），不过未来需在衰老或成年白内障模型中验证以增强转化相关性。随后讨论RORA作用的背景与特异性：RORs（核受体转录因子）参与多种眼病，RORA常在其他衰老背景下发挥细胞保护（如调节抗氧化防御与线粒体功能），但本研究发现其在LECs中加重氧化应激与衰老，这反映了RORA的细胞类型特异性、环境依赖性及靶通路机制特异性；本研究首次报道RORA在ARC中异常上调及促病作用，RORA抑制减轻白内障进展，但晶状体靶向药物递送是当前临床转化瓶颈，未来需开发纳米载体、眼用缓释制剂等靶向递送系统。然后讨论PRNP的角色与实验设计：PRNP（由PRNP基因编码的细胞表面糖蛋白）调控氧化应激、衰老与凋亡，既往研究提示其在氧化应激中上调；本研究使用的重组PRNP蛋白缺乏GPI锚定修饰，作为可溶性蛋白在玻璃体腔扩散至晶状体前囊膜，通过内吞进入LECs，且PRNP作为内源性蛋白免疫原性低，玻璃体注射生物相容性良好；本研究首次通过玻璃体注射重组PRNP蛋白将PRNP的促衰老/应激效应与RORA转录因子关联，并在体内外验证。最后总结研究意义：该研究为RORA调控氧化应激驱动的LECs衰老与凋亡响应提供新视角，未来将在RORA敲除ARC模型中探索PRNP的作用，并评估靶向RORA-PRNP轴的小分子抑制剂对ARC预防的治疗潜力，为ARC及其他年龄相关性眼病提供有效治疗靶点的新思路。

研究结论部分翻译：在这项研究中，研究人员证明转录因子RORA在氧化应激下的晶状体上皮细胞（LECs）中显著上调，这一发现在三个实验环境中一致观察到：分离的ARC患者前囊膜组织、Na₂SeO₃诱导的白内障大鼠模型及H₂O₂刺激的SRA01/04细胞模型。为剖析RORA的功能作用，研究人员在体外进行双重干预实验（敲减/激活），结果表明RORA敲减减轻H₂O₂诱导的LECs细胞衰老与凋亡，而RORA激活加剧这些病理过程；体内实验中，在Na₂SeO₃诱导的白内障大鼠模型中药物抑制RORA（使用SR3335）显著减少晶状体混浊并改善晶状体的组织学特征。在机制层面，研究人员利用全转录组测序鉴定RORA的下游介质，筛选出朊蛋白基因（PRNP）作为候选靶点；双荧光素酶报告实验证实RORA可特异性结合PRNP启动子并转录激活之；后续验证确认体外PRNP过表达逆转RORA敲减的保护效应，体内给予重组PRNP蛋白加重白内障模型大鼠的晶状体混浊与病理损伤——进一步支持PRNP作为RORA的下游效应因子。总之，这些数据确立RORA作为LECs细胞衰老与凋亡的关键调节因子，并凸显其作为白内障治疗靶点的潜力。