《HUMAN MUTATION》：A New Wnt1 Mutant Rat Model of Osteogenesis Imperfecta and Its Application in AAV9-Mediated Gene Therapy
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成骨不全（Osteogenesis Imperfecta，OI）是一种遗传异质性与临床异质性并存的骨骼系统疾病，目前已发现超过20个致病基因参与其发病进程。此前研究人员在中国常染色体隐性成骨不全（Autosomal Recessive OI，AR-OI）患者群
成骨不全（Osteogenesis Imperfecta，OI）是一种遗传异质性与临床异质性并存的骨骼系统疾病，目前已发现超过20个致病基因参与其发病进程。此前研究人员在中国常染色体隐性成骨不全（Autosomal Recessive OI，AR-OI）患者群体中鉴定到WNT1基因c.620G＞A（p.Arg207His）错义突变。本研究旨在明确WNT1功能缺失在OI发生中的致病作用，并评估腺相关病毒（Adeno-Associated Virus，AAV）介导的基因治疗能否改善骨表型异常。研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了Wnt1R207H/R207H纯合突变大鼠模型，并通过股骨骨髓腔直接注射方式向OI大鼠递送AAV9-Wnt1病毒以验证其治疗潜力。结果显示，与杂合子及野生型同窝对照相比，纯合Wnt1R207H/R207H大鼠可重现AR-OI的核心临床特征，包括自发性骨折、骨量降低、生长迟缓、生存率下降、破骨细胞数量增多、成骨细胞功能与矿化能力下降。体外实验表明，Wnt1过表达可促进成骨细胞的活性与骨基质矿化能力。体内治疗实验中，AAV9-Wnt1干预显著恢复了OI大鼠的骨密度与力学强度，提升成骨细胞活性、抑制破骨细胞活性，并上调Ⅰ型胶原的表达水平。本研究证实WNT1 c.620G＞A（p.Arg207His）突变具有明确致病性，同时证明AAV介导的Wnt1基因治疗是治疗WNT1突变所致OI的潜在有效策略。
研究背景与意义
成骨不全（Osteogenesis Imperfecta，OI）是一类以骨脆性增加与骨量降低为核心特征的遗传性骨骼疾病，遗传模式与致病机制高度异质。超过85%的病例呈常染色体显性遗传，由编码Ⅰ型胶原的COL1A1与COL1A2基因突变导致；其余多为常染色体隐性成骨不全（Autosomal Recessive OI，AR-OI），涉及至少18个参与骨发育调控的基因。近年研究发现，WNT1基因突变可导致XV型成骨不全（OI-XV），属于严重型常染色体隐性遗传病，其核心致病机制为成骨细胞分化功能障碍。当前OI临床管理以对症支持为主，双膦酸盐类药物虽可提升骨密度，但无法纠正成骨细胞功能缺陷，对WNT1相关OI疗效有限，尚无针对病因的根治性手段。此前研究人员在中国AR-OI队列中发现，WNT1是该类疾病中突变频率最高的基因，其中c.620G＞A（p.Arg207His）为反复出现的致病突变，因此构建对应动物模型并探索基因治疗方案具有重要的临床转化价值。该研究发表于《HUMAN MUTATION》。
关键技术方法
研究人员首先纳入携带WNT1 c.620G＞A纯合突变的中国AR-OI家系样本进行遗传学验证；随后采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建同源突变的大鼠模型，通过微计算机断层扫描（micro-computed tomography，μCT）、三点弯曲力学测试、组织学染色等手段完成骨骼表型表征；分离原代成骨细胞与破骨细胞开展体外功能实验；最终通过股骨骨髓腔内注射AAV9-Wnt1病毒实施体内基因治疗干预，结合分子生物学检测评估治疗效果。
研究结果
3.1 鉴定到WNT1 c.620G＞A（Arg207His）纯合突变
研究人员在一名表现为重度OI的临床样本中检测到WNT1 c.620G＞A纯合突变，父母均为杂合携带者。多物种序列比对显示突变位点p.Arg207高度进化保守，蛋白结构预测提示该突变会破坏其与邻近氨基酸的氢键相互作用，支持其致病性。
3.2 Wnt1R207H/R207H大鼠模型的构建与表征
通过CRISPR/Cas9技术成功获得Wnt1+/+、Wnt1+/R207H与Wnt1R207H/R207H三种基因型大鼠。纯合突变大鼠出生率为16.2%，其中31.25%在出生后3周内死亡，部分个体出现与人类患者一致的眼睑下垂表型。影像学与组织学分析显示，突变大鼠存在骨量减少、生长迟缓、胶原纤维含量下降、自发性胫骨骨折伴骨痂形成等典型OI特征。
3.3 微CT与生物力学分析
μCT结果显示，纯合突变大鼠骨体积分数（Bone Volume/Total Volume，BV/TV）较野生型下降约50%，骨小梁数量（Trabecular Number，Tb.N）、骨小梁厚度（Trabecular Thickness，Tb.Th）与皮质骨厚度（Cortical Thickness，Cort.Th）均显著降低，骨小梁分离度（Trabecular Separation，Tb.Sp）升高。三点弯曲实验证实其股骨最大载荷与刚度显著下降，骨力学性能受损。
3.4 成骨细胞与破骨细胞体外活性分析
细胞增殖实验显示三种基因型大鼠的成骨细胞增殖能力无显著差异，但纯合突变组碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）染色与茜素红染色显示成骨分化与矿化能力明显下降；抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-Resistant Acid Phosphatase，TRAP）染色显示破骨细胞生成增加。定量PCR结果进一步验证成骨标志物ALP、RUNX2、OPN、OCN表达下调，破骨标志物TRAP、RANK、OSCAR、NFATc1表达上调。
3.5 成骨细胞中Wnt1过表达的体外效应
向OI大鼠来源成骨细胞转染AAV9-Wnt1后，Ⅰ型胶原（Type I Collagen，COL1）蛋白水平无明显变化，但ALP与茜素红染色显示成骨分化与矿化能力显著恢复，接近甚至超过野生型水平。
3.6 AAV9-Wnt1对骨骼表型的体内挽救效应
3.6.1 股骨形态与力学性能
治疗6周后，AAV9-Wnt1注射侧股骨皮质骨厚度显著增加，最大载荷与断裂能量较PBS对照组明显提升，骨骼宏观形态改善。
3.6.2 μCT骨密度分析
治疗组骨密度与BV/TV显著升高，其余骨微结构参数呈改善趋势但未达统计学显著性。
3.6.3 股骨应力分析
三点弯曲测试显示治疗组股骨骨折所需最大载荷显著增加，最大延伸距离呈上升趋势但无统计学差异。
3.6.4 骨组织学分析
Masson染色显示治疗组胶原纤维含量回升，TRAP染色显示骨小梁表面破骨细胞数量减少，提示AAV9-Wnt1可促进胶原沉积并抑制破骨细胞生成。
3.6.5 破骨细胞标志物表达
治疗组破骨基因RANK、OSCAR、NFATc1的mRNA表达量较OI组呈下降趋势，但未达统计学显著性。
讨论与结论
AR-OI尤其是WNT1相关的XV型OI临床表型严重，现有治疗手段难以实现病因纠正，迫切需要靶向治疗策略。重组腺相关病毒（Recombinant Adeno-Associated Virus，rAAV）因低毒性、低免疫原性与持续转基因表达能力，已成为极具潜力的基因递送载体。研究人员此前在中国AR-OI队列中发现WNT1突变占比高达40.54%，其中c.620G＞A（p.Arg207His）为高频致病突变，本研究构建的对应点突变大鼠模型完整模拟了人类OI-XV的骨骼与部分神经系统表型，且不同突变位点可导致表型差异。既往Wnt1小鼠模型多未观察到类似的高死亡率与严重骨骼畸形，凸显该大鼠模型的临床相关性。rAAV9可成功携带全长WNT1 cDNA，局部注射后显著提升OI大鼠骨密度、改善骨微结构与力学性能，从体外与体内层面验证了Wnt1过表达对骨形成的促进作用与破骨抑制效应。尽管部分参数改善未达显著水平，仍为AR-OI的基因治疗提供了概念验证。综上，本研究首次建立了携带中国人群高频WNT1突变的OI大鼠模型，证实AAV介导的Wnt1基因治疗可有效部分挽救骨表型，为WNT1相关OI的临床转化奠定了坚实基础。
