《HUMAN MUTATION》：Bioinformatics Combined With Biological Experiments to Explore the Promotion of Lung Metastasis by CCL18 in the Immune Microenvironment of Colorectal Cancer
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背景：结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是常见的恶性肿瘤之一，肿瘤转移是导致预后不良的重要因素，其中肺转移是CRC最常见的腹腔外转移方式，但肺转移性CRC尚未得到足够关注。因此，该研究的主要目的是发现肺转移的关键基因并改善CRC预后。
背景：结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是常见的恶性肿瘤之一，肿瘤转移是导致预后不良的重要因素，其中肺转移是CRC最常见的腹腔外转移方式，但肺转移性CRC尚未得到足够关注。因此，该研究的主要目的是发现肺转移的关键基因并改善CRC预后。
方法：通过分析基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）获取原发肿瘤与肺转移CRC患者之间的差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）。采用预后生存分析、癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）差异表达分析及单基因基因集富集分析（Single-Gene Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）筛选DEGs。
结果：结合患者预后与表达差异，研究人员发现CCL18是CRC肺转移的关键基因。巨噬细胞共培养及Transwell实验验证了CCL18促进CRC细胞侵袭转移能力及增殖能力的潜力。
该研究发表于《HUMAN MUTATION》，旨在探究结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）肺转移的分子机制并寻找改善患者预后的关键靶点。
研究背景方面，CRC是全球高发病率、高死亡率的恶性肿瘤，尽管早期手术和化疗可治愈部分患者，但多数患者确诊时已属晚期并伴有远处转移，预后极差。肿瘤转移，特别是肝转移和肺转移，是CRC相关死亡的主要原因。肺转移在转移性CRC中占比达20%~30%，且预后常较肝转移更差。然而，CRC肺转移的生物学机制研究相对不足，早期检测和靶向干预手段亟待开发。CRC肿瘤并非孤立存在，而是浸润在由基质细胞、血管和免疫细胞等构成的复杂肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中。TME通过促进癌细胞与免疫成分的相互作用在癌症进展中发挥关键作用。肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）是TME中数量最多的免疫细胞亚群之一，具有显著的可塑性，可分为促炎性的"巨噬细胞M1型（M1）"表型和抗炎性的"巨噬细胞M2型（M2）"表型。在实体瘤中，TAMs常向M2样状态极化，促进肿瘤免疫逃逸和转移。TME中产生的趋化因子不仅招募免疫细胞，还直接作用于癌细胞。CC趋化因子配体18（CC Chemokine Ligand 18, CCL18）是一种与M2巨噬细胞相关的趋化因子，主要由人巨噬细胞和未成熟树突状细胞表达，在肿瘤进展中具有重要作用。基于上述背景，研究人员假设TAMs分泌的CCL18在肺转移微环境中驱动肿瘤侵袭性和免疫逃逸，而肿瘤细胞对CCL18的产生贡献甚微。
研究所用的主要关键技术方法包括：从GEO数据库获取三个独立的基因表达微阵列数据集（GSE41258、GSE68468和GSE131418），这些数据集包含原发CRC肿瘤样本和转移性CRC样本；利用R语言的limma包进行转录组差异表达分析，筛选标准为|log2(倍数变化)| > 1且p < 0.05；通过KMplot在线工具进行Kaplan-Meier生存分析评估候选基因的预后相关性，并利用GEPIA网络服务器在TCGA-COAD/READ队列中验证候选基因表达；利用LinkedOmics平台进行单基因基因本体论（Gene Ontology, GO）和GSEA分析；从SangerBox平台下载预计算的免疫浸润评分，分析CCL18表达与免疫细胞浸润的相关性；查询癌细胞系百科全书（Cancer Cell Line Encyclopedia, CCLE）数据库以确认CRC细胞是否内在表达CCL18；采用THP-1细胞系诱导分化为M2型巨噬细胞，通过小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）转染敲低CCL18表达，运用酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）、实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Fluorescent PCR, RT-qPCR）、Transwell细胞侵袭实验、CCK-8细胞增殖检测及克隆形成实验等体外实验验证CCL18的功能效应。
研究结果部分按以下结构展开：
3.1 CRC肺转移中的差异表达基因：利用GEO发现数据集，研究人员鉴定出一组在CRC肺转移中相对于原发肿瘤发生失调的基因。三个数据集分别产生数十个显著差异表达基因（校正p < 0.05，|log倍数变化| > 1）。交叉比较后发现，有5个上调基因和3个下调基因共同存在于三个数据集中，这些重叠的DEGs可能代表了CRC肺转移的特异性标志。
3.2 关键基因与CRC预后的关联：Kaplan-Meier生存曲线分析表明，CCL18高表达与CRC患者更差的总生存期（Overall Survival, OS）和更短的无复发生存期（Recurrence-Free Survival, RFS）显著相关（log-rank p < 0.01）。MMP3也表现出不良预后趋势，但不如CCL18明显。相反，表面活性蛋白基因SFTPA2/SFTPD（在转移中下调）的高表达与更好的生存相关。这些数据突出了CCL18作为CRC进展相关功能基因的重要性。
3.3 核心基因在CRC中的表达：通过GEPIA分析TCGA中CRC患者与GTEx中相对正常组织的表达谱，发现仅CCL18和MMP3在CRC组织中特异性高表达，而ACTG2、C3和FMO2呈低表达；SFTPA2、SFTPD和EXOC5在CRC组织与正常组织间无显著差异表达。综合预后分析和表达差异，研究人员选择CCL18进行后续分析。
3.4 富集分析将CCL18与免疫和转移通路关联：对TCGA CRC数据按CCL18高表达与低表达分组进行单基因GSEA分析，结果显示高CCL18样本富集了免疫抑制、侵袭和上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）相关基因集，如NF-κB信号通路、炎症反应和细胞黏附分子通路（FDR < 0.01）。免疫浸润分析表明，CCL18表达与CRC中的免疫浸润相关，且与M2极化巨噬细胞（抗炎性和促肿瘤性）的相关性最强。
3.5 肿瘤细胞缺乏内在CCL18表达：CCLE数据库分析显示所有检测的上皮性癌细胞系中CCL18 mRNA几乎检测不到；人类蛋白质图谱也报道CCL18蛋白不表达于癌细胞而富集于肿瘤浸润免疫细胞。实验室中对HCT116、SW480和SW620等CRC细胞系进行RT-PCR也未检测到CCL18转录本。这些结果证实CCL18并非CRC上皮细胞的自分泌产物，而是来源于免疫细胞浸润。
3.6 M2极化巨噬细胞分泌CCL18并增强CRC侵袭性：研究人员将THP-1巨噬细胞用IL-4和IL-13（各20 ng/mL）诱导M2极化，24小时后TGF-β和IL-10表达略有增加，48小时和72小时后所有M2标志物的mRNA和蛋白水平均显著升高。ELISA确认了TGF-β、IL-10和CCL18的蛋白表达模式。通过Transwell共培养实验发现，与M2极化THP-1共培养的CRC细胞比正常CRC细胞更易穿过小室，而M0组无显著变化，表明M2极化巨噬细胞促进CRC细胞的侵袭转移能力。
3.7 CCL18促进TME中CRC细胞侵袭和增殖：为确认是CCL18而非TME中其他因子显著增强肿瘤侵袭转移，研究人员在M2极化巨噬细胞中敲低CCL18表达，与CRC细胞共培养后发现其侵袭转移能力受到抑制；另一方面，用重组CCL18处理CRC细胞也增强了其侵袭转移能力。此外，CCL18暴露可适度增加CRC细胞增殖速率，而在CCL18被沉默的含M2巨噬细胞免疫微环境中培养时增殖受到抑制。这些结果表明，除促进侵袭外，CCL18可能赋予肿瘤细胞生长优势。
讨论部分，研究人员强调该研究将CCL18鉴定为与CRC肺转移密切相关的关键基因，并证实TAM来源的CCL18能够显著增强CRC细胞的侵袭和增殖行为。研究工作强化了TME在转移中起决定性作用的概念。M2极化TAMs与CCL18高表达及患者不良预后相关，CCL18不仅作为M2 TAM浸润的标志物，还主动促进免疫抑制性和促肿瘤性微环境的形成。CCL18能够诱导调节性T细胞（Regulatory T Cells, Tregs）分化和招募，并形成使巨噬细胞向M2表型极化的正反馈环路。此外，CCL18可直接促进肿瘤转移，如在乳腺癌中CCL18通过结合癌细胞上的受体PITPNM3触发整合素β1聚集，促进细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）黏附、迁移和跨内皮侵袭。该研究在CRC中观察到类似现象：CCL18暴露增加了CRC细胞通过Matrigel的侵袭能力。关于CCL18在CRC中的受体，CCR8和PITPNM3可能参与其中，但尚需进一步研究。
研究人员指出，CRC肺转移具有独特性，肺组织免疫监视较强且基质组成不同，肺微环境可能强烈诱导或选择CCL18表达TAMs。从临床角度，CCL18可作为CRC患者肺转移风险的生物标志物，也可作为治疗靶点，如通过耗竭TAMs、将TAMs从M2重编程为M1，或直接中和CCL18本身。CCR8抑制剂/抗体正在早期试验中 investigated，可能与检查点阻断联合增强抗肿瘤免疫。该研究的局限性包括：体内验证尚待完成；CCL18在CRC细胞中的精确受体和信号通路有待阐明；共培养实验使用的THP-1细胞系模型虽方便可重复，但原代患者巨噬细胞可能提供额外见解。
研究结论部分翻译如下：总之，该研究将CCL18鉴定为CRC肺转移的关键促进因子。通过整合生物信息学和实验验证，研究人员证明CCL18在CRC肺转移组织中显著上调且与患者不良预后相关。CCL18通过促进免疫逃逸和直接增强癌细胞侵袭及EMT能力塑造促转移性TME。共培养实验证实巨噬细胞来源的CCL18在体外显著增加CRC细胞侵袭和增殖。这些发现表明CCL18驱动肺部肿瘤进展和转移性生长，使其成为治疗干预的有前景候选靶点。从临床角度看，CCL18可作为转移性CRC的预后生物标志物和潜在药物靶点。CCL18丰富肿瘤的患者可能受益于靶向TAM/CCL18轴的治疗。该研究的创新之处在于阐明了CCL18在CRC肺转移中的作用，这一背景此前研究不足。通过强调M2 TAM-CCL18-癌细胞相互作用的重要性，该研究为破坏这一相互交流的新策略铺平了道路。最终结论指出，该研究全面揭示了以M2巨噬细胞来源的CCL18为代表的肿瘤免疫微环境如何促进CRC转移的深入见解，这些发现强化了有效癌症治疗必须超越癌细胞本身、同时靶向支持其扩散的支持性生态系统的理念。CCL18是促肿瘤炎症、免疫抑制和转移激活的汇聚点，中和CCL18或其效应的治疗努力可能显著损害转移性进展并改善CRC患者尤其是肺转移患者的预后。
