富含迷迭香酸的香薷提取物通过miR-138-5p/FOXC1通路对人滋养层细胞氧化及炎症损伤的保护作用

《Biochemistry Research International》：Protective Role of Rosmarinic Acid–Enriched Elsholtzia kachinensis Extract Against Oxidative and Inflammatory Stress in Human Trophoblasts Through the miR-138-5p/FOXC1 Pathway

　　

炎症诱导的微小RNA（microRNA, miRNA）调控紊乱，尤其是miR-138-5p的异常表达，可损害滋养层细胞功能并可能导致妊娠相关并发症。尽管香薷属（Elsholtzia）植物已被报道具有治疗特性，但香薷（Elsholtzia kachinensis Prain, EKP）在滋养层细胞中的抗炎效应尚未被探索。本研究中，70%乙醇提取的EKP经分离得到己烷（HEX）、二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯（ETAC）及水（WT）组分。各组分经植物化学分析、抗氧化活性评估及气相色谱-质谱联用（GC-MS）和高效液相色谱（HPLC）生物活性成分鉴定。其中，乙酸乙酯组分（EKP-ETAC）展现出最强的抗氧化活性，在ABTS和DPPH测定中表现为最低IC₅₀值，且含有最高水平的酚类和黄酮类化合物。研究人员通过MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）实验确定了无毒性浓度。EKP-ETAC预处理可缓解脂多糖（LPS）诱导的HTR-8/SVneo滋养层细胞增殖、迁移和侵袭功能损伤，同时减少细胞凋亡、细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成及炎症细胞因子表达。机制分析表明，EKP-ETAC抑制LPS诱导的miR-138-5p上调并恢复叉头框C1（forkhead box C1, FOXC1）表达。双荧光素酶报告基因实验证实FOXC1为miR-138-5p的直接靶基因，介导EKP-ETAC的效应。液相色谱-质谱联用（LC-MS）及HPLC分析鉴定迷迭香酸（rosmarinic acid）为主要生物活性成分。研究结果表明，富含迷迭香酸的EKP-ETAC通过miR-138-5p/FOXC1轴减轻氧化应激和炎症，对滋养层细胞发挥保护作用。

滋养层细胞是胎盘发育的核心功能单位，承担着胎儿与母体界面的物质交换、激素分泌及子宫螺旋动脉重塑等关键生理过程。其功能异常可导致胎盘灌注不足，进而引发子痫前期、流产、早产及胎儿神经发育障碍等一系列妊娠并发症。近年来研究表明，炎症因子诱导的微小RNA表达失调在滋养层功能障碍中扮演重要角色，其中miR-138-5p被证实在妊娠期糖尿病中呈高表达，且与滋养层细胞增殖、迁移及侵袭能力下降密切相关。尽管传统药用植物香薷属植物具有悠久的抗炎应用历史，但作为该属物种之一的香薷（Elsholtzia kachinensis Prain, EKP），其分子机制尚未被阐明。基于此，研究人员开展了EKP提取物对LPS诱导炎症损伤下滋养层细胞保护作用的系统研究，相关成果发表于《Biochemistry Research International》。

研究人员采用的细胞模型为HTR-8/SVneo人滋养层细胞系，该细胞系由Charles H. Graham教授馈赠，培养于含10%胎牛血清及1%青霉素/链霉素的RPMI培养基中。植物材料采自泰国清莱府，凭证标本编号0023398保存于清迈大学药学院植物标本馆。研究综合运用了植物化学分离、体外抗氧化活性测定、细胞功能学检测、流式细胞术、定量逆转录PCR（qRT-PCR）及双荧光素酶报告基因等技术方法。

在提取与植物化学分析方面，研究人员采用70%乙醇提取EKP干燥材料，得率17.5%，继而依次用己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和水进行液液分配，得到HEX、DCM、ETAC和WT四个组分。通过Folin-Ciocalteu法测定总酚含量（total phenolic content, TPC），铝离子比色法测定总黄酮含量（total flavonoid content, TFC）。抗氧化活性采用ABTS^•+（2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）和DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基清除实验评估，以IC₅₀值作为评价指标。结果显示，EKP-ETAC组分表现出最优的抗氧化活性，其ABTS和DPPH的IC₅₀值分别为3.51±0.10 μg/mL和12.77±0.14 μg/mL，与阳性对照抗坏血酸和Trolox相当，同时该组分TPC和TFC亦为最高。

在细胞毒性及功能保护效应方面，研究人员通过MTT实验确定EKP-ETAC在50 μg/mL以下无显著毒性，选取10和40 μg/mL作为后续实验浓度。BrdU（5-溴-2'-脱氧尿苷）掺入实验表明，EKP-ETAC预处理可有效逆转LPS诱导的滋养层细胞增殖抑制。Transwell迁移实验及Matrigel侵袭实验显示，LPS使细胞迁移率降低35%、侵袭率降低25%，而EKP-ETAC预处理可恢复至接近正常水平。

在抗炎与抗氧化机制方面，qRT-PCR检测证实EKP-ETAC可显著抑制LPS诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α（肿瘤坏死因子-α）等促炎细胞因子上调。流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染实验显示，EKP-ETAC减少LPS诱导的细胞凋亡和坏死；细胞周期分析表明其可降低亚G1期细胞比例，缓解G0/G1期阻滞。此外，EKP-ETAC预处理显著降低H₂O₂诱导的细胞内ROS水平，证实其直接抗氧化作用。

在分子机制层面，芯片预测结合实验验证揭示了miR-138-5p/FOXC1调控轴的核心作用。LPS刺激显著上调miR-138-5p表达，而EKP-ETAC呈剂量依赖性抑制该效应。生物信息学分析预测FOXC1为miR-138-5p潜在靶基因，TargetScan数据库显示其在FOXC1 3'-非翻译区（3'-UTR）160-167位点存在保守结合位点。实验证实，LPS处理下调FOXC1 mRNA水平，而EKP-ETAC预处理可恢复其表达；miR-138-5p mimic转染显著抑制FOXC1表达，双荧光素酶报告基因实验进一步验证FOXC1为miR-138-5p的直接靶基因。

在活性成分鉴定方面，LC-MS分析从EKP-ETAC中鉴定出8种主要化合物，包括咖啡酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷、5,6-二羟基-3',4',7,8-四甲氧基黄酮、迷迭香酸、香草醛、芹菜素、苯甲醛和亚油酸。HPLC定量分析表明迷迭香酸含量最高，达2083 μg/mL，远高于绿原酸、香草醛和木犀草素等成分，确定为EKP-ETAC的主要功能性成分。

讨论部分系统回顾了香薷属植物的传统应用价值，指出EKP在泰国北部和中国西南地区作为食用蔬菜及民间抗炎药物的历史。研究人员将本研究与白藜芦醇、姜黄素、槲皮素等已报道具有妊娠保护作用的天然活性成分进行了比较，强调EKP-ETAC通过多靶点、多途径发挥作用的独特优势。特别指出的是，该研究首次在滋养层细胞中建立EKP-ETAC的抗炎保护模型，并阐明其通过"miR-138-5p↑→FOXC1↓"轴的调控机制，为理解该植物传统应用提供了现代科学证据。研究同时指出，EKP-ETAC的活性不仅源于迷迭香酸，也包括香草醛、木犀草素等次要成分的协同贡献。

研究结论部分明确指出：本研究揭示了EKP-ETAC在管理妊娠炎症相关并发症方面的显著治疗潜力。通过证实其强效的抗氧化和抗炎特性，EKP-ETAC有效调控关键分子通路，包括下调miR-138-5p表达和恢复FOXC1表达，从而支持滋养层细胞功能。其减少氧化应激、抑制促炎细胞因子、增强滋养层细胞增殖、迁移和侵袭能力的作用，使EKP-ETAC成为一种有前景的天然治疗剂。这些发现为深入探索EKP及其生物活性成分在临床中应用于妊娠并发症及其他炎症驱动疾病提供了坚实基础。