干血斑采样方法比较：用于反兴奋剂中基于RNA的生物标志物检测

《Drug Testing and Analysis》：Comparison of Dried Blood Spot Sampling Methods for RNA-Based Biomarker Measurement in Anti-Doping

　　

干血斑(DBS)采样具有后勤优势，但目前尚不清楚不同DBS采样方法的分析结果是否可比。本研究旨在探究静脉血或毛细血管血滴于纤维素卡，或通过Tasso-M20设备采集的样本，在反兴奋剂领域针对红细胞生成的RNA生物标志物——5-氨基乙酰丙酸合酶(ALAS2)和碳酸酐酶1(CA1)的检测中是否具有可比性。在瑞士运动员群体(n=12)中，研究人员在常规反兴奋剂程序中收集了DBS样本（静脉-纤维素卡和Tasso-M20）。在健康志愿者群体(n=12)中，研究人员在为期3周的重组人促红细胞生成素(rEPO)给药研究基线、给药后1周及停药后10天收集了DBS样本（静脉-纤维素卡、毛细血管-纤维素卡和Tasso-M20）。研究人员采用逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对ALAS2和CA1mRNA进行定量，并通过Passing–Bablok回归评估不同基质间的一致性。ALAS2和CA1的表达在各基质间表现出强线性一致性（相关系数r≥0.96）。Passing–Bablok回归显示，在所有比较中ALAS2均不存在恒定或比例偏差。对于CA1，在运动员群体中静脉-纤维素卡与Tasso-M20之间无偏差，而在rEPO研究中，当Tasso-M20 DBS与静脉或毛细血管纤维素卡DBS比较时，观察到约9%–22%的比例偏差。在给药研究的任一时间点，各基质间的相对RNA表达均无显著差异。ALAS2和CA1可在静脉或毛细血管来源的纤维素卡DBS及Tasso-M20 DBS样本中可靠定量。强一致性和极小偏差（CA1的偏差相对于预期生物学或治疗诱导的变异性较小）支持其用于纵向监测，从而在研究和反兴奋剂中实现侵入性更低、更灵活且去中心化的采样。

该研究发表于《Drug Testing and Analysis》，聚焦于反兴奋剂领域中红细胞生成相关mRNA生物标志物的干血斑采样方法学验证。当前，传统静脉采血在反兴奋剂检测中存在流程繁琐、储存运输条件苛刻等问题，而干血斑采样虽具备微创、室温稳定性高及物流便捷等优势，且已被世界反兴奋剂机构(WADA)纳入技术规范，但其不同采集方式（如静脉血滴卡、指尖毛细血管采血、自动化采集设备）的分析结果一致性尚未明确。特别是5-氨基乙酰丙酸合酶(ALAS2)和碳酸酐酶1(CA1)作为新兴的红细胞生成敏感标志物，其对血液兴奋剂（如重组人促红细胞生成素rEPO微剂量使用）的检测效能已得到证实，且受海拔、铁剂注射等混杂因素影响较小，有望成为运动员生物护照的重要补充。然而，若不同干血斑采样基质导致检测结果出现显著偏差，将限制其在纵向监测中的实际应用。因此，研究人员亟需系统评估不同干血斑采样方法对上述RNA生物标志物的定量可比性，以推动去中心化、高频次的反兴奋剂检测策略落地。

研究人员采用了两项独立的队列研究验证方法学可靠性。第一项队列来自瑞士体育诚信组织(SSI)的精英运动员群体，包含6名男性及6名女性耐力项目运动员，在其常规反兴奋剂流程中同步采集静脉EDTA全血滴于Whatman 903纤维素卡（静脉-纤维素卡）及Tasso-M20设备采集样本，并在6个月内进行3至4次纵向随访。第二项队列为重组人促红细胞生成素(rEPO)给药临床研究，纳入12名健康男性志愿者，在3周干预期内接受每周三次、每次50 IU·kg^?1的倍他依泊汀皮下注射，并于基线、给药第7天(T7)及停药后10天(T10)三个时间点，同步采集静脉-纤维素卡、指尖毛细血管-纤维素卡及Tasso-M20三种基质样本。所有样本均采用统一方案进行RNA提取、逆转录及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析，并以GAPDH、RGCC L和RGCC C作为内参基因进行归一化，最终通过Friedman检验和Passing–Bablok回归评估基质间的一致性与偏差。

3.1 运动员群体中静脉-纤维素卡与Tasso-M20样本的ALAS2和CA1分析比较

研究人员对运动员群体的两种采样基质进行比较，结果显示ALAS2和CA1在静脉-纤维素卡与Tasso-M20间均表现出强相关性（相关系数r=0.97）。Passing–Bablok回归的斜率接近1，且95%置信区间包含1，表明两种方法对ALAS2和CA1的定量仅存在约5%和1%的比例偏差，无统计学意义，支持其在真实世界运动员监测中的互换性。

3.2 rEPO给药队列中静脉-纤维素卡、毛细血管-纤维素卡及Tasso-M20样本的ALAS2和CA1分析比较

在rEPO给药诱导的红细胞生成加速（T7）及减速（T10）动态变化中，三种基质的ALAS2相对表达量在各时间点均无显著差异。Passing–Bablok回归显示，ALAS2在不同基质间的比例偏差仅为1%–3%，无恒定或比例偏差。对于CA1，三种基质的表达水平在各时间点同样无统计学差异，但Passing–Bablok回归揭示Tasso-M20与静脉-纤维素卡、毛细血管-纤维素卡相比，分别存在9%和22%的比例偏差，而毛细血管与静脉纤维素卡间无显著偏差。尽管如此，所有比较的相关系数均≥0.96，显示出强线性关联。

讨论部分指出，虽然CA1在Tasso-M20与其他纤维素卡基质间存在轻微比例偏差，但该偏差远小于rEPO给药引起的200%–300%表达变化、高原暴露导致的40%–50%波动以及运动员自然生理变异（约30%–40%）。因此，这种偏差在实际反兴奋剂应用中不会影响对红细胞生成刺激效应的判断。ALAS2则在不同基质间完全可互换。两项队列研究覆盖了从生理基线到药理诱导的极端变化范围，证实了干血斑采样的稳健性和普适性。

研究结论明确，红细胞生成相关的RNA生物标志物ALAS2和CA1可在静脉或毛细血管血纤维素卡DBS及Tasso-M20设备采集的DBS中可靠定量。各基质间的强一致性和相对于生物变异极小的偏差，支持这些采样方法在分析上的等效性，适用于纵向监测。干血斑采样的可行性和灵活性使得侵入性更低、频次更高的检测成为可能，并支持在实验室或比赛场所以外的去中心化采样，且不损害分析可靠性。这些发现共同支持了干血斑采样在反兴奋剂及科研领域中对ALAS2和CA1进行RNA生物标志物评估的实际应用，凸显了其作为红细胞生成活性监测补充生物标志物的潜力。