《The Lancet Regional Health - Southeast Asia》：Targeted next-generation sequencing for direct drug-resistant tuberculosis detection in sputum samples in Indonesia: an implementation study (2024–25)
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靶向二代测序（targeted Next Generation Sequencing，tNGS）用于耐药性结核病（drug-resistant tuberculosis，DRTB）的检测，是结核病（TB）诊断领域的一项重要进展，但其在结核病高发环境中的最佳实施
靶向二代测序（targeted Next Generation Sequencing，tNGS）用于耐药性结核病（drug-resistant tuberculosis，DRTB）的检测，是结核病（TB）诊断领域的一项重要进展，但其在结核病高发环境中的最佳实施方式、检测产出及成本效益仍不明确。研究人员旨在围绕实验室工作流程、实施级联（implementation cascade）、周转时间及单位成本，对tNGS进行评估。
研究人员于2024年8月1日至2025年10月10日在印度尼西亚西爪哇省级参比实验室，对痰标本应用Deeplex Myc-TB开展tNGS前瞻性实施评估。纳入对象为来自32家医院和15家社区卫生中心、经Xpert诊断为利福平耐药结核病（rifampicin-resistant TB，RRTB）的患者；上述机构合计覆盖该省51.0%的RRTB患者。
在收集到的1210份RRTB痰标本中，812份（67.1%）完成测序，其中429/812（52.8%）获得完整读段，164/812（20.2%）获得部分读段。tNGS成功率取决于细菌负荷：Xpert高负荷标本成功率为88.8%，而极低负荷标本为0%。大多数样本被确认为RR/MDR TB（89.2%），前广泛耐药结核病（pre-XDR TB）和广泛耐药结核病（XDR TB）分别占10.6%和0.2%。工作流程优化改善了测序表现，最终流程的实验室成功率达到82.4%（201/244）。从样本接收到获得测序结果，tNGS的中位周转时间为8天（四分位距〔IQR〕6–10）。按每份样本计算，iSeq平台的tNGS总单位成本为263.6美元，MiSeq平台为239.6美元。
tNGS在痰中DNA负荷较高的患者中表现良好，且具有相对较快的周转时间。其进一步优化与广泛采用应综合考虑DRTB疾病负担、样本筛选、测序平台选择及相关成本。
该论文发表于《The Lancet Regional Health - Southeast Asia》，聚焦在结核病高负担国家真实世界项目化情境下，如何将靶向二代测序（targeted Next Generation Sequencing，tNGS）直接应用于痰标本，以实现耐药性结核病（drug-resistant tuberculosis，DRTB）的快速耐药谱检测。研究背景在于，当前DRTB诊断金标准仍为表型药物敏感性试验（phenotypic drug susceptibility testing，pDST），但该方法耗时长、技术要求高，并依赖较强的实验室基础设施。世界卫生组织推荐的分子快速诊断（molecular WHO-recommended rapid diagnostics，mWRDs），如Xpert MTB/RIF或Xpert Ultra及MTB/XDR，虽能更快识别耐药结核病，但药物覆盖范围有限，尤其对贝达喹啉、利奈唑胺、氯法齐明等新型或再利用抗结核药物的耐药检测能力不足。tNGS因此被认为具有重要潜力，但其在高负担、资源受限地区的实施可行性、流程稳定性、实际周转时间及成本资料仍较缺乏，尤其缺少在常规卫生服务体系中的操作性评估。
印度尼西亚结核病负担位居全球前列，耐药结核病诊断不足及pDST回报缓慢的问题尤为突出。既往资料显示，当地仅有少数估算DRTB患者得到诊断，而pDST结果通常平均需要约两个月方可获得。在此背景下，研究人员在西爪哇开展了前瞻性实施研究，尝试尽可能贴近国家结核病项目（programmatic context）的实际条件，系统评价tNGS直接检测痰标本的实施流程、级联损失、实验室优化策略、结果产出、周转时间和单位成本。研究表明，tNGS在高细菌负荷痰标本中的应用效果较好，经过流程优化后实验室成功率可明显提升，并能在中位8个工作日内提供较全面的耐药信息；但其总体成功仍显著依赖样本细菌负荷，且实施成本较高、技术复杂度大，提示其大规模纳入常规DRTB诊断体系仍需审慎规划。
本研究主要采用以下关键技术与方法：在印度尼西亚西爪哇47个临床点位（32家DRTB医院、15家配备Xpert的社区卫生中心）连续收集经Xpert Ultra确诊的利福平耐药肺结核患者痰标本，并在西爪哇省级公共卫生实验室统一开展检测。样本经复检Xpert Ultra分层后，使用NALC-NaOH去污染、QIAamp DNA Mini Kit提取DNA，采用Deeplex Myc-TB进行靶向PCR扩增，Illumina建库后在iSeq 100或MiSeq i100 plus平台测序。研究通过连续4轮工作流程优化，比较不同预处理策略对测序完成率和可解释结果的影响；同时构建tNGS实施级联，统计各环节损耗、周转时间，并以微观成本法（micro-costing）测算单位成本。
研究结果部分首先呈现了整体实施级联与样本流转表现。研究期间共有1210份经Xpert确认的RRTB痰标本送达省级实验室，覆盖研究期西爪哇全部已确诊RRTB患者的51.0%。患者中男性占多数，超过三分之一有既往结核病史。样本来源几乎均为DRTB医院。尽管纳入样本数量较大，但从样本接收到最终获得可解释测序结果的全过程中存在明显损耗。约五分之一标本因体积不足、外观质量不佳、复检Xpert为阴性或“trace”而未进入后续检测。最终，在符合条件并进入直接痰标本测序流程的样本中，812份完成测序，593份获得可解释结果，提示在常规项目条件下，tNGS从接收到最终输出结果之间存在较显著的实施折损。
在“Workflow evolution and evaluated tNGS success across different workflows”部分，研究重点分析了实验室流程优化对检测性能的影响。研究人员先后经历4轮工作流程调整：第一阶段纳入Xpert半定量分级为high、medium、low和very low的标本直接处理；第二阶段因低产出，对low和very low样本先培养后测序；第三阶段加入提取前珠磨（bead-beating）以改善low样本直接测序；第四阶段进一步在提取中增加离心步骤，并最终将very low样本排除于直接tNGS之外。结果显示，流程优化后，完成测序的比例持续改善，最终流程中264份样本有244份完成测序，201份获得完整或部分读段，实验室成功率达到82.4%。值得注意的是，优化带来的提升主要体现在部分读段增加，而完整读段比例并未显著上升。这说明流程改进确实提升了总体可解释性，但在读段完整性方面仍存在局限。
在“tNGS sequencing results by sputum bacterial load”部分，研究明确证明了细菌负荷是影响tNGS成功的关键决定因素。对于Xpert Ultra半定量结果为high或medium的样本，86.9%可获得完整或部分测序结果；而low样本该比例仅为44.6%。若依据抗酸杆菌（acid-fast bacilli，AFB）涂片结果分层，AFB阳性样本中82.4%获得可解释结果，而AFB阴性样本仅为60.0%。当进一步聚焦完整读段时，成功率在Xpert high类别最高，为88.8%，在very low类别则降至0%。这一结果说明，tNGS虽能直接应用于痰标本，但其性能高度依赖痰中分枝杆菌DNA丰度，尤其对低菌量样本不够稳健。这也是该技术在真实世界高负担环境中推广时必须正视的核心瓶颈。
在耐药谱检测结果方面，研究显示，在593份获得Deeplex可解释结果的样本中，89.2%属于RR/MDR TB，其中RRTB占39.5%，MDR占49.7%；另有10.6%为pre-XDR TB，0.2%为XDR TB。这表明tNGS在项目场景下不仅能确认利福平耐药，还可提供更宽广的耐药信息，有助于发现更高等级耐药类型。与此同时，部分药物位点存在较高比例的不完整结果，尤其是利奈唑胺，其次为二线注射类药物卡普霉素、阿米卡星和卡那霉素。这意味着即便tNGS能够提供更广泛的耐药谱，在某些关键药物上的结果完整性仍需进一步提升，否则可能影响临床对优化治疗方案的判断。
在“turnaround time”相关结果中，研究显示，从痰标本送达西爪哇省级实验室至tNGS结果可用，中位周转时间为8个工作日，四分位距为6–10天。此后临床医生再接收到结果还需额外中位3天。与传统pDST相比，这一速度明显更快，也与NGS药敏检测7天左右的推荐临床实践标准较为接近。研究还报告，实施期间多数样本使用iSeq测序，平均每周运行两个批次，另有部分样本采用MiSeq i100 plus处理；不同平台的批处理规模存在差异，这也可能对周转时间和成本构成影响。总体来看，tNGS在时间维度上具有较强优势，能够更快地为DRTB患者提供更全面的耐药信息。
在“Calculation of the tNGS unit costs”部分，研究对tNGS的项目实施成本进行了较为细致的分解。若按包含样本筛查的每样本总成本计算，iSeq 100平台为285.4美元，MiSeq i100 plus平台为261.4美元；若按完成测序样本进行核算，单位成本分别为263.6美元和239.6美元。成本构成中，DNA提取、Deeplex PCR、文库构建和测序等核心流程占绝大部分，超过95%，提示tNGS成本的主要驱动因素来自试剂耗材和核心实验步骤，而人员培训与人力成本占比较小。这一结果强调，在资源有限国家，tNGS的推广不仅取决于技术可行性，也高度受制于平台采购、试剂供应链和总体经费承受能力。
讨论部分指出，本研究最大的价值在于从项目实施视角完整描绘了tNGS在高负担地区省级参比实验室中的真实运行表现，而非仅停留于实验室准确性评估。研究证实，tNGS可以在常规医疗体系中实施，并能在高菌量样本中取得较好表现，但总体成功率仍低于部分既往研究，原因可能包括纳入了更多低质量、低菌量样本，以及真实世界流程更加复杂。研究人员强调，技术复杂性是tNGS纳入国家结核病项目的主要障碍之一。实验步骤繁复、故障排查要求高、数据分析和结果解读缺乏标准化，均可能制约其在常规体系中的落地。尤其是部分读段增加虽然提升了表面成功率，但不完整结果会削弱临床可解释性，特别是在利奈唑胺等关键药物上可能妨碍治疗决策。
论文还讨论了tNGS实施的系统条件。研究人员认为，tNGS目前更适合设置于转诊实验室，而非基层机构，因为其对基础设施、生物安全条件和专业人员能力要求较高。此外，tNGS前端依赖高质量Xpert Ultra筛查，因此若上游分子诊断体系存在试剂断供、样本采集不规范或转运网络薄弱等问题，均会进一步削弱tNGS表现。基于此，论文提出，未来若要扩大应用，需要根据本地实验室能力建立经过本地验证的流程，并在国家DRTB诊断算法中明确tNGS的定位、样本入选标准和转诊路径；同时，还应将其嵌入国家结核病信息系统和治疗指南，以便开展更系统的临床效用与成本效果评价。
研究结论部分可译为：本研究提示，针对痰标本开展项目化DRTB检测时，tNGS的更广泛实施需要谨慎权衡。当前，鉴于其对高水平基础设施和熟练技术人员的要求，tNGS仅在转诊实验室中具有可行性。应依据实验室能力开发经本地验证的工作流程，并持续提供样本采集与测序支持培训。耐药测序的前提是基于Xpert Ultra的结核病优化诊断。为确保tNGS得到最佳利用，必须在国家DRTB诊断算法中明确其定位与检测标准。将tNGS纳入国家结核病信息系统和DRTB治疗指南，有助于在关注耐药负担、转诊网络、样本类型、样本量及基础设施成本的基础上，系统评价其临床效用与成本效果，并支持其可持续性。同时，鉴于tNGS单位成本较高，仍有必要探索其他测序平台及融资方案，以促进成本下降。
