双功能催化光热免疫制剂用于铁死亡诱导与cGAS-STING通路激活：增强肿瘤免疫治疗并产生 robust 免疫记忆

《Materials Today Bio》：Dual-Functional Catalytic Photothermal Immunological Agent for Ferroptosis Induction and cGAS-STING Pathway Activation: Enhancing Tumor Immunotherapy and Generating Robust Immune Memory

　　

肿瘤细胞凋亡抗性与免疫逃逸显著增加癌症治疗失败的风险。铁死亡作为一种新型策略，为克服肿瘤凋亡抗性提供了新途径。然而，传统铁死亡诱导剂常因谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的补偿机制而导致耐药性，而光热-免疫治疗的协同效应可规避这一局限。此外，仅依赖固有免疫治疗可能无法有效抑制"冷"肿瘤及免疫抑制性微环境介导的侵袭性肿瘤，从而诱发免疫逃逸。本研究中，研究人员精心构建了一种温和光热免疫治疗纳米平台Fe-Mn@GOx纳米颗粒（Fe-Mn@GOx NPs），旨在诱导非凋亡性铁死亡、增强cGAS-STING（cyclic GMP-AMP synthase-stimulator of interferon genes，环鸟苷酸-腺苷酸合酶-干扰素基因刺激蛋白）通路激活并增强固有抗肿瘤免疫。该策略直接破坏热休克蛋白（HSP）结构，以恢复癌细胞敏感性并增强抗肿瘤免疫。值得注意的是，Fe-Mn@GOx NPs介导的铁死亡可诱导肿瘤细胞内活性氧（ROS）水平升高。此外，葡萄糖耗竭本身主要影响三磷酸腺苷（ATP）水平。ROS介导的氧化损伤与ATP耗竭诱导的功能抑制协同抑制HSP表达，从而为温和光热免疫治疗提供有效途径。更为关键的是，Fe-Mn@GOx NPs诱导的死亡细胞碎片中含有的肿瘤源性内源性DNA可进一步激活巨噬细胞中的cGAS-STING通路，同时促进长期免疫记忆T细胞的产生。铁死亡与cGAS-STING通路之间的相互作用触发系统性抗肿瘤免疫的快速诱导，导致肿瘤生长抑制。该工程化纳米治疗平台通过特异性cGAS-STING通路激活实现了一种新型肿瘤免疫治疗策略。

该研究聚焦于肿瘤免疫治疗领域，针对肿瘤细胞凋亡抗性与免疫逃逸导致的临床治疗失败这一关键问题，探索了基于铁死亡与光热免疫治疗协同作用的新型治疗策略。肿瘤细胞常对凋亡或坏死凋亡等细胞死亡程序产生耐受性，严重削弱了基于免疫原性细胞死亡（ICD）的抗肿瘤策略疗效。铁死亡作为一种独特的非凋亡性程序性细胞死亡方式，独立于经典凋亡调控因子的致癌突变，可克服传统凋亡抵抗，被视为改善免疫抑制性肿瘤微环境的新途径。然而，肿瘤细胞内在氧化还原稳态系统对活性氧（ROS）介导损伤的抵抗能力，特别是谷胱甘肽（GSH）依赖的抗氧化防御机制，限制了单一铁死亡策略的治疗效果。与此同时，光热治疗（PTT）虽具微创、低毒、操作便捷等优势，但治疗过程中热休克蛋白（HSP）过表达所激活的细胞保护性适应可削弱PTT损伤效应，导致治疗失败。此外，仅依赖固有免疫治疗难以有效遏制"冷"肿瘤及免疫抑制性微环境，易诱发免疫逃逸。基于上述挑战，研究人员亟需开发能够整合多种治疗模态、兼顾内在机制关联的先进治疗策略。

本研究中，研究人员构建了一种自催化增强的温和光热治疗策略，通过Fe-Mn@GOx纳米颗粒同时实现铁死亡诱导与cGAS-STING（cyclic GMP-AMP synthase-stimulator of interferon genes）通路激活。该纳米平台兼具铁死亡触发剂与cGAS-STING通路激动剂双重功能，针对三阴性乳腺癌发挥强效治疗作用。其核心设计包括：Fe-Mn双金属催化中心原位转化内源性H₂O₂为细胞毒性•OH，降解HSP以增强过渡金属介导的温和光热治疗；葡萄糖氧化酶（GOx）耗竭葡萄糖限制ATP合成，逆转HSP诱导的肿瘤热耐受性；GSH耗竭使细胞"ROS清除剂"失效，累积过量ROS促进脂质过氧化（LPO）最终引发铁死亡；死亡细胞碎片释放的外源性DNA进一步激活cGAS-STING通路，实现双向激活。该策略通过激活cGAS-STING信号通路唤醒固有免疫，驱动肿瘤相关巨噬细胞（TAM）复极化和树突状细胞（DC）成熟以增强抗原呈递，促进肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）浸润并生成长期记忆T细胞。

研究人员采用的核心技术方法包括：通过铁/锰离子与儿茶酚配体（2,3,6,7,10,11-六羟基三苯，HPT）的一步自组装及GOx一锅法包载制备Fe-Mn@GOx NPs；利用透射电子显微镜（TEM）、动态光散射及Zeta电位表征纳米颗粒理化性质；红外热成像评估808 nm激光照射下的光热转换性能；DCFH探针检测ROS产生，TMB比色法及ESR波谱验证类过氧化物酶（POD-like）活性及•OH生成；Calcein-AM/PI活死细胞染色、MTT法及Western blot评估体外抗肿瘤效应；检测GSH、MDA、4-HNE、NADPH水平及铁死亡相关蛋白表达确证铁死亡机制；CD光谱分析HSP结构变化；RNA测序及GSEA分析基因表达谱；将处理后肿瘤细胞上清与巨噬细胞共培养，Western blot及RT-PCR检测cGAS-STING通路激活；建立4T1荷瘤小鼠模型，瘤内注射后联合808 nm激光（0.8 W/cm²，10 min）照射评估体内抗肿瘤活性；流式细胞术分析肿瘤免疫微环境；40天肿瘤清除后进行再挑战实验验证免疫记忆效应。

制备与表征方面，Fe-Mn@GOx NPs粒径约164.5 nm，Zeta电位5.2 mV，7天内保持稳定。808 nm激光照射5分钟内可升温至50°C以上，具浓度依赖性光热响应及良好光热稳定性。GOx酶活经NIR照射后保持稳定，纳米平台表现出浓度依赖性葡萄糖消耗及ROS产生能力，POD-like催化活性经TMB显色及ESR捕获•OH验证。

体外治疗效应与机制方面，Fe-Mn@GOx NPs组PI红色荧光显著增强，联合NIR组死细胞比例最高，MTT定量结果一致。ICD标志物检测显示CRT表面暴露、ATP释放及HMGB1释放显著增加。细胞内GSH水平显著降低，NIR照射后效果进一步增强；MDA和4-HNE含量显著升高；铁死亡相关蛋白FSP1、HO-1、GPX4表达变化确证氧化应激及铁死亡触发。NADPH水平显著降低，证实GOx纳米酶催化NADPH耗竭阻碍GSH再生、灭活GPX4、促进LPO导致铁死亡的机制。Ferrostatin-1（铁死亡抑制剂）较Z-VAD-FMK（凋亡抑制剂）更高程度恢复细胞活力，表明铁死亡在细胞死亡中占主导地位。体内免疫抑制实验显示，Ferrostatin-1处理导致M1巨噬细胞、DC活化显著降低，M2巨噬细胞增加，进一步证实铁死亡对免疫激活的重要贡献。CD光谱证实HSP70特征性正峰消失，强负峰出现，谱峰位移表明二级结构被破坏；Western blot显示HSP70和HSP90表达明显下调，激光照射后进一步降低，表明催化治疗与光热治疗协同增效。

RNA测序与分析方面，样本内相关系数达0.98，组间约0.7，表明处理组与对照组存在显著生物学差异。差异表达分析鉴定3720个上调和3411个下调基因。通路富集分析显示上调基因主要与自噬、凋亡和内质网应激相关，下调基因主要涉及mRNA加工和DNA复制。GSEA分析证实凋亡和内质网应激通路显著上调，热图可视化关键凋亡相关基因表达谱，为纳米系统通过光热处理显著抑制肿瘤细胞增殖提供证据。

cGAS-STING通路激活方面，肿瘤细胞DNA在PTT过程中释放至肿瘤微环境（TME）。巨噬细胞经不同处理组4T1细胞上清处理后，Fe-Mn@GOx NPs单药或联合NIR组显著上调STING、IRF3和P65磷酸化水平及cGAS表达，联合组效应最强。STING抑制剂H151显著降低p-STING、cGAS和p-P65表达，证实该激活依赖经典cGAS-STING通路。下游ISGs检测显示IFNB1、CXCL10、CCL5和IL-6表达显著升高，P65和IRF3部分核转位，表明通路激活并启动下游信号。

体内抗肿瘤活性方面，纳米颗粒快速蓄积于肿瘤部位，8小时达荧光峰，保留至48小时。4T1荷瘤小鼠分组治疗后，Fe-Mn@GOx NPs联合NIR组生物发光信号下降最显著，肿瘤生长曲线显示最优抑瘤效果。H&E、TUNEL和Ki-67组织学分析证实组织损伤、凋亡和增殖抑制，CRT表面染色最显著，表明更强ICD诱导效应。各组小鼠体重无显著变化，溶血试验及主要器官H&E染色证实良好生物安全性与生物相容性。

免疫调节能力方面，Fe-Mn@GOx NPs联合NIR组成熟DC比例达44.4%，M1巨噬细胞比例57.9%，M2巨噬细胞比例35.3%，M1/M2比值最高。血清IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平最高，表明可激发系统性抗癌免疫应答并重编程肿瘤微环境。

长期抗癌记忆方面，原发肿瘤根除40天后，治愈小鼠与同龄 naive 小鼠同时再次接种4T1-Luc细胞。Fe-Mn@GOx NPs联合NIR组治愈小鼠未出现肿瘤，而naive小鼠快速成瘤。脾细胞流式分析显示，效应记忆T细胞（T_EM，CD3⁺CD44⁺CD62L^-）和中央记忆T细胞（T_CM，CD3⁺CD44⁺CD62L⁺）在CD4⁺和CD8⁺T细胞群体中均显著升高，表明该疗法可显著促进记忆T细胞表型形成，建立针对复发性乳腺癌的持久免疫记忆。

研究结论部分，研究人员采用整合固有免疫应答与肿瘤靶向PTT的综合策略，同时应对乳腺癌多种免疫抑制机制。该自催化增强温和PTT策略通过直接破坏HSP结构恢复肿瘤细胞敏感性，通过诱导铁死亡和唤醒固有免疫增强抗肿瘤免疫。Fe-Mn@GOx NPs同时作为铁死亡诱导剂和cGAS-STING免疫佐剂用于三阴性乳腺癌治疗。研究证实，ROS增强和葡萄糖水平降低显著抑制HSP表达，为Fe-Mn@GOx NPs的温和PTT提供有效手段。死亡肿瘤细胞释放大量细胞DNA，激活TME中巨噬细胞等邻近免疫细胞的cGAS-STING通路，将免疫抑制性"冷"TME转化为免疫活性"热"TME。该策略可有效诱导T细胞分化为T_CM，放大T细胞在肿瘤组织中的蓄积，并抑制复发肿瘤增殖。