受蒲公英“捣烂外敷”疗法启发的用于糖尿病伤口护理的医用敷料

《Materials Today Bio》：Medical dressing inspired by dandelion “smashed for external application” therapy for diabetic wound care

　　

开发能够重塑病理微环境的生物活性敷料，对糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer, DFU）的管理至关重要。受中药蒲公英（Taraxacum mongolicumHand.-Mazz.）传统“捣烂外敷”用法启发，研究人员构建了仿生薄膜TH-EVLPs@CNF-，将新鲜蒲公英汁来源的细胞外囊泡样颗粒（extracellular vesicle-like particles, EVLPs）与蒲公英残渣衍生的羧基化纤维素纳米纤丝（carboxylated cellulose nanofibrils, CNF-）整合。CNF-基质表现出优异的生物相容性与多功能特性：促进细胞增殖，动态调控巨噬细胞从促炎M1表型向修复性M2表型极化，并通过血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）信号通路促进血管生成。基于“药辅同源”理念，抗炎性TH-EVLPs以109particles/cm2的高载量负载于CNF-薄膜中并实现按需释放，通过胶原重组与血管再生，在14天内将糖尿病伤口闭合率提升至96%（未治疗对照组为56%），发挥协同促愈作用。该研究阐释了蒲公英传统外用实践中“药用成分与辅料一体化”的设计理念，同时为基于同源生物活性物质的医用敷料一体化成型工艺提供了新思路。

论文解读

糖尿病足溃疡（DFU）是糖尿病最严重的并发症之一，全球每年约1860万人受累，患者5年死亡率达30%，截肢后死亡率超70%。糖尿病患者慢性高血糖会引发周围神经病变与外周动脉疾病，伤口一旦出现，常伴随反复感染、持续炎症与深部组织坏死，进展为难以愈合的慢性溃疡。当前临床管理以清创、减压为主，疗效有限；常用敷料分为传统基础敷料（如纱布）与现代湿性敷料（如壳聚糖、海藻酸盐敷料），前者换药时易损伤新生肉芽组织造成二次创伤，后者（含银敷料、保湿敷料）促愈效果有限且成本较高（单片中位价格约人民币66.3元，折合9.54美元）。现有敷料在皮肤相容性、疗效与安全性上仍无法满足临床需求，亟需开发专用DFU敷料。

巨噬细胞极化异常是DFU迁延难愈的核心机制：生理状态下，伤口愈合增殖期巨噬细胞会从促炎M1表型向修复性M2表型转换；但糖尿病患者体内晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products, AGEs）、活性氧（reactive oxygen species, ROS）与活性氮（reactive nitrogen species, RNS）水平升高，阻碍这一极化进程，同时合并血管病变与血管生成受损，导致持续炎症与愈合延迟。蒲公英是传统药用植物，其鲜汁外用可治疗多种痈肿疮毒，前期研究发现鲜蒲公英汁含大量细胞外囊泡样颗粒（TH-EVLPs），可通过抑制NLRP3炎症小体、核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）通路发挥强效抗炎作用，但TH-EVLPs无法直接促进细胞增殖或迁移，且其伤口局部滞留、控释仍是临床应用难点。

受蒲公英“捣烂外敷”传统用法启发，研究人员以蒲公英全株为原料，构建了负载自源TH-EVLPs的仿生纤维素基敷料TH-EVLPs@CNF^-。研究首先以江苏徐州产新鲜蒲公英为样本，经榨汁、分级离心、超滤分离获得TH-EVLPs；蒲公英残渣经碱处理、漂白、高压均质制备纤维素纳米纤丝（cellulose nanofibrils, CNF），进一步通过2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基（2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl, TEMPO）氧化法制备阴离子CNF（CNF^-），通过环氧丙基三甲基氯化铵改性制备阳离子CNF（CNF⁺），通过64%硫酸水解法制备纤维素纳米晶体（cellulose nanocrystals, CNC）。采用透射电镜、zeta电位、X射线光电子能谱表征材料理化性质；通过薄膜浇铸法制备不同纳米纤维素薄膜，评估其孔隙率、吸水性、接触角与力学性能；以小鼠皮肤伤口模型评估薄膜黏附性；采用CCK-8、活死染色、划痕实验评估材料对L929成纤维细胞、iBMDM巨噬细胞、人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）的黏附、增殖、迁移影响；通过RT-qPCR、酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、转录组测序分析CNF^-对巨噬细胞极化的调控机制；通过成管实验评估材料对内皮细胞血管生成的影响；采用荧光分光光度法分析TH-EVLPs的负载与pH响应释放行为，拟合释放动力学模型；最终以db/db糖尿病小鼠全层皮肤缺损模型验证敷料体内促愈效果，通过苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色、Masson三色染色、免疫荧光染色分析伤口组织修复、胶原沉积、巨噬细胞极化与血管生成情况。所有动物实验均经南京中医药大学动物伦理委员会批准（编号202311A004），遵循实验动物护理与使用指南。

3.1 蒲公英源纳米纤维素的制备与表征

研究人员通过不同改性路线获得4种蒲公英源纳米纤维素：未改性CNF呈直径5~10 nm、长度400~1000 nm的互联纤维网络；阳离子改性CNF⁺形貌与未改性CNF相近但纤维聚集更明显；TEMPO氧化CNF^-纤维长度缩短至100~400 nm，网络更均匀规整；酸水解CNC呈特征棒状，直径5~10 nm、长度20~60 nm。Zeta电位验证改性成功：CNF为-11.33±1.01 mV，CNF⁺为+7.66±0.52 mV，CNF^-为-18.53±0.81 mV，CNC为-43.47±2.20 mV。傅里叶变换红外光谱与X射线光电子能谱证实CNF⁺引入季铵基团，CNF^-引入羧基，CNC引入磺酸基。薄膜表征显示：CNF^-孔隙率高于CNC与CNF⁺，表面粗糙度30~150 nm，适宜细胞黏附；吸水能力较未改性CNF提升4倍，水接触角低至20°，亲水性优异；弹性模量为102.15±9.61 MPa，断裂伸长率达7.76±0.23%，兼顾刚度与韧性。

3.2 蒲公英源纳米纤维素薄膜对细胞黏附与定植的影响

CCK-8与活死染色结果显示：CNF与CNC涂层会抑制iBMDM、L929、HUVECs的黏附；CNF⁺与CNF^-涂层黏附性能优异，其中CNF⁺对iBMDM与L929的黏附效率达80%，高于CNF^-的70%，可能与阳离子电荷和细胞膜阴离子静电作用有关；两种涂层抗胰酶消化能力显著，10分钟胰酶处理后仍保留95%以上黏附细胞；共聚焦三维成像显示细胞可浸润并锚定于纳米纤维素基质的三维多孔结构中。

3.3 蒲公英源纳米纤维素薄膜对细胞增殖与血管生成的影响

CNF与CNC涂层抑制iBMDM与L929增殖，CNF^-与CNF⁺则促进增殖，其中CNF^-促增殖效果最强；iBMDM在CNF^-涂层上呈伸长的梭形形态，为M2巨噬细胞极化的典型特征。HUVECs在CNF^-涂层上增殖受抑但形成管状结构，补充暴露实验证实该现象并非细胞毒性，而是内皮细胞从增殖向分化、结构重塑的功能转换；成管实验显示CNF^-的化学成分无直接促管生成作用，其三维空间结构与界面特性是促血管生成的核心机制。

3.4 蒲公英源纳米纤维素薄膜对巨噬细胞极化与细胞迁移的影响

RT-qPCR与ELISA结果显示：CNF^-可显著抑制脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的M1型促炎因子（肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-1β）表达，同时上调M2型抗炎因子（精氨酸酶-1、Ym-1、白细胞介素-10、转化生长因子-β、VEGF）分泌，而CNF⁺无显著免疫调节作用。转录组测序与富集分析表明，CNF^-通过调控NOD样受体、Toll样受体、TNF、NF-κB、MAPK等多条炎症相关通路，重塑巨噬细胞转录组谱，缓解过度炎症反应，促进M2极化。划痕实验显示CNF^-可使L929细胞24小时划痕愈合率提升约20%，CNF⁺无显著影响。

3.5 TH-EVLPs负载纳米纤维素薄膜的制备与表征

研究人员通过吸附-冻干法制备三种负载TH-EVLPs的纳米纤维素薄膜：TH-EVLPs@CNF⁺、TH-EVLPs@CNF^-、TH-EVLPs@CNF^±（CNF⁺与CNF^-质量比1:1）。荧光定量显示载量分别为11.48×10⁹、7.58×10⁹、11.32×10⁹particles/cm²；150 mM NaCl屏蔽静电作用后，CNF^-载量提升至14.99×10⁹particles/cm²，证实静电作用是负载的关键机制之一；干燥薄膜的吸湿能力提升进一步增强载量。释放实验显示TH-EVLPs@CNF^-的释放具有pH依赖性：pH 4~5时6小时内近100%释放，近中性或碱性条件下48小时内释放约80%；动力学拟合符合Ritger-Peppas模型（R²>0.99），为菲克扩散机制（n<0.45），可实现糖尿病慢性伤口的按需稳定缓释。

3.6 TH-EVLPs负载纳米纤维素薄膜的体内伤口愈效

db/db小鼠全层皮肤缺损模型治疗结果显示：第14天时，TH-EVLPs@CNF^-组伤口闭合率达96.18±1.51%，显著高于TH-CNF⁺组（72.01±1.64%）、TH-CNF^-组（84.34±2.61%）与游离TH-EVLPs组（80.59±1.97%）。分子检测证实TH-EVLPs@CNF^-可最显著降低伤口组织M1型促炎因子mRNA与蛋白表达，同时显著提升M2型抗炎因子与生长因子（精氨酸酶-1、白细胞介素-10、转化生长因子-β、VEGF）的表达。

3.7 糖尿病伤口的组织病理学与免疫荧光分析

H&E与Masson染色显示：治疗7天后，TH-EVLPs@CNF^-组肉芽组织形成更丰富、皮肤结构更完整；14天时几乎完全再上皮化，胶原基质成熟且排列有序。免疫荧光结果显示：TH-EVLPs@CNF^-治疗14天后，伤口M1标志物CD86与促炎因子白细胞介素-6表达显著降低，M2标志物CD206与抗炎因子精氨酸酶-1表达显著升高，同时血管内皮标志物CD31表达显著上调，证实其通过促进M1向M2极化、增强血管生成发挥促愈作用。

讨论与结论

传统中药“捣烂外敷”疗法虽经验证有效，但其机制（尤其是植物纤维素的功能角色）尚未明确。本研究将传统智慧与纳米材料创新结合，把TH-EVLPs整合入工程化纳米纤维素支架，复现了新鲜植物基质中的天然分散状态。在各类纳米纤维素变体中，阴离子CNF^-因高孔隙率、可调吸水性、pH响应释放动力学成为最优载体，其纳米纤维结构可促进成纤维细胞迁移、内皮细胞成管与M2巨噬细胞极化等关键再生过程。体内实验证实TH-EVLPs@CNF^-通过三重机制实现协同促愈：一是pH依赖的TH-EVLPs持续抗炎作用，二是微环境重塑，三是血管生成激活，疗效显著优于单一组分治疗。

该研究一方面为蒲公英鲜用外治提供了科学依据，另一方面为基于同源生物活性物质的医用敷料一体化设计提供了新策略。研究同时指出，蒲公英源成分的促愈活性不排除其他植物来源材料也可实现的可能，未来需通过与其它药用植物EVLPs或合成仿生支架的对比研究，进一步明确植物源材料在再生纳米材料领域的独特地位。本研究发表于《Materials Today Bio》。