空间与功能保守的斑马鱼rgra与rgrb基因双敲除模型揭示RGR对视锥细胞介导的明视觉完整性、明视觉循环及布鲁赫膜形态学维持的必需性

《The FASEB Journal》：Dual Knockout Models of the Spatially and Functionally Conserved rgra and rgrb Zebrafish Genes Reveal the Requirement of RGR for the Integrity of Cone-Mediated Photopic Vision, the Photopic Visual Cycle and Bruch's Membrane Morphology

　　

视网膜G蛋白偶联受体（Retinal G Protein-Coupled Receptor, RGR）是一种视觉循环光异构酶（photoisomerase），在明视觉（photopic）条件下光化学再生11-顺式-视黄醛（11-cis-retinal, 11cRAL），对维持视觉具有关键作用。本研究利用视锥细胞占优的斑马鱼视网膜模型，系统探究了RGR在体功能，重点分析了RGR缺失对视觉功能的影响。斑马鱼存在两个RGR旁系同源基因rgra和rgrb，二者均在视网膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelium, RPE）和Müller胶质细胞中优势表达。在标准光照饲养条件下，定制的rgrb^?/?; rgra^?/?双敲除斑马鱼相对于野生型（Wild-Type, WT）呈现约21%的视动反应（Optokinetic Response, OKR）扫视频率降低。该视觉行为缺陷在20 000–81 000 lx的更高明视觉条件下进一步加剧。相反，暗适应条件下未观察到显著的OKR缺陷，巩固了RGR在视觉中的光依赖性作用。rgrb^?/?; rgra^?/?斑马鱼幼鱼的类视黄醇（retinoid）图谱分析显示，在标准和更明亮光照饲养条件下11cRAL水平显著降低。蛋白质组学分析验证了rgrb^?/?; rgra^?/?斑马鱼的成功构建，并揭示了眼部细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）蛋白的意外上调。偏振光显微镜观察发现，视网膜与脉络膜交界处布鲁赫膜（Bruch's membrane）的胶原纤维丰度增加且组织排列紊乱。这些新发现证明了RGR在维持视锥细胞介导明视觉条件下视觉功能、伴随的明视觉循环缺陷，以及维持布鲁赫膜完整性方面的新作用。

## 研究背景与问题提出

视觉色素的生色团11-顺式-视黄醛（11cRAL）是光转导过程中必需的光敏感性维生素A醛，其再生对于维持视觉至关重要。 phototransduction过程中视觉色素的11-顺式到全反式异构化需要被逆转以恢复视觉功能。维生素A主要储存于外层视网膜的视网膜色素上皮（RPE），而光感受器使用活性生色团11cRAL进行光转导。视锥细胞对颜色检测和明亮环境中的光子感知至关重要，因此视锥细胞是明视觉（即在明亮条件下的视觉过程）所必需的。由异构酶RPE65驱动的经典视觉循环利用视黄酯再生11cRAL，但在明视觉条件下该循环不足以满足需求。视网膜G蛋白偶联受体（RGR）被认为是介导明视觉条件下11cRAL再生的替代视觉循环的关键分子。RGR属于视蛋白GPCR家族，具体为视网膜光异构酶亚家族成员。RGR在多种物种中具有保守性，包括人类、牛、小鼠和鸡，但不存在于有袋类动物基因组中。RGR是一种七跨膜蛋白，主要在视网膜的RPE和Müller胶质细胞中表达。

与RGR突变相关的眼部疾病包括遗传性视网膜变性（Inherited Retinal Degeneration, IRD）和年龄相关性黄斑变性（Age-Related Macular Degeneration, AMD）。目前仅确认一种致病性RGR变异与IRD相关，患者表现出多种视网膜改变。在AMD中，主要临床标志是RPE与布鲁赫膜之间玻璃膜疣（drusen）的堆积。值得注意的是，一种RGR剪接变体RGR-d主要定位于RPE细胞的基底侧，且在布鲁赫膜中有沉积报道。RGR作为非视觉视蛋白，在视网膜中发挥视觉循环光异构酶的作用，结合全反式-视黄醛（atRAL）在光照条件下生成11cRAL。RGR还通过保守赖氨酸残基的席夫碱连接介导底物结合。除光生11cRAL外，RGR还在光照和黑暗条件下调控视黄酯水平：光照时Rgr敲除小鼠中全反式-视黄酯（atRE）显著增加；黑暗条件下RGR抑制卵磷脂视黄醇酰基转移酶（Lecithin Retinol Acyltransferase, LRAT）和全反式-视黄酯水解酶活性。RGR还被报道介导atRE从脂滴储存池到内质网中异构酶池的转运。

然而，迄今尚未有研究利用体内视锥细胞优势模型探究RGR的生物学功能，也未报道RGR敲除对功能性视觉的影响。斑马鱼作为脊椎动物模式生物，其视网膜为视锥细胞优势型，与昼夜行为相关。由于全基因组复制事件，斑马鱼常具有哺乳动物基因的两个同源拷贝。斑马鱼中存在两个RGR旁系同源基因rgra和rgrb。斑马鱼眼球发育迅速，受精后5天（5 dpf）即形成功能性视觉系统，因此可在标准、暗视和明视条件下进行功能性视觉检测。本研究旨在利用CRISPR-Cas9构建的双敲除rgrb^?/?; rgra^?/?斑马鱼，探究rgra和rgrb在视觉生物学中的作用。RGR光异构酶活性所需的光照水平和波长存在情境依赖性变化，例如Rgr^?/?小鼠暴露于4 000 lx 8小时或1 400/14 000 lx 10小时后总视网膜水平显著降低；体外牛RGR在530 nm光下最大量光生11cRAL。

## 主要技术方法

本研究采用的关键技术方法包括：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建rgra、rgrb单敲除及rgrb^?/?; rgra^?/?双敲除斑马鱼系，通过Sanger测序和PCR基因分型验证；定量PCR（qPCR）检测mRNA表达水平；视动反应（OKR）行为学检测评估视觉功能，包括在标准光照（~450 lx）、暗适应及高光照强度（20 000–81 000 lx）条件下的测试；高效液相色谱（HPLC）进行类视黄醇图谱分析；免疫荧光成像观察视网膜形态；甲苯胺蓝组织学分析；基于数据非依赖性采集平行累积序列碎裂（dia-PASEF）的质谱蛋白质组学分析，使用DIA-NN软件进行数据处理，并通过DAVID进行通路富集分析；苦味酸-天狼星红（PSR）染色结合偏振光显微镜及二次谐波产生（SHG）显微技术评估布鲁赫膜胶原纤维组织结构。样本来源包括UCD斑马鱼设施的AB/TL品系斑马鱼幼鱼（<131 hpf）及成年鱼。

## 研究结果

**斑马鱼rgra和rgrb旁系同源基因在RPE中具有最强的视网膜表达**

研究人员通过分析公开的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据库Daniocell（胚胎至幼鱼阶段）及成年斑马鱼视网膜数据集，发现rgra和rgrb从早期发育至成年均主要在RPE中表达，rgrb在RPE中的表达略高于rgra；而在Müller胶质细胞中rgra表达强于rgrb。系统发育分析显示斑马鱼Rgra和Rgrb蛋白与人类RGR的保守性分别为56.36%和41.18%，关键视黄醛生色团结合赖氨酸残基（Lys255/K7.43）、七跨膜结构域及保守GPCR基序均得到保留。

**rgra^?/?、rgrb^?/?及rgrb^?/?; rgra^?/? CRISPR-Cas9斑马鱼模型的构建**

研究人员针对rgra（7个外显子，位于13号染色体）外显子2和4设计CRISPR向导RNA，产生2 209 bp缺失；针对rgrb（9个外显子，位于12号染色体）外显子2和4设计向导，最终产生341 bp缺失（位于外显子3和4之间）。基因分型PCR验证了突变等位基因，qPCR显示rgra^?/?中rgra mRNA降低约60%，rgrb^?/?中rgrb mRNA降低约77%，双敲除中分别降低约79%和76%。单敲除和双敲除斑马鱼均显示正常发育，无显著形态学异常。

**幼鱼rgrb^?/?; rgra^?/?双敲除显示视觉行为受损、明视觉循环缺陷及RPE-脉络膜交界形态异常**

在标准光照饲养条件下（14 h光——~450 lx，10 h暗），rgrb^?/?; rgra^?/?双敲除幼鱼OKR扫视频率较WT显著降低20.7%（p=0.0003），而单敲除无显著差异，提示功能冗余性。暗适应约4.5–6小时后，双敲除与WT间无显著差异（p=0.4145），表明表型具有光依赖性。类视黄醇分析显示标准光照下双敲除幼鱼11cRAL水平显著降低54.6%（p=0.0357），而其他类视黄醇无显著变化；暗适应14小时后11cRAL水平无显著差异。免疫荧光显示视锥细胞标记物zpr1和外节标记物peripherin-2表达无变化，视网膜层化正常，但双敲除出现RPE与脉络膜之间的非预期间隙。

**更高明视光照强度下幼鱼视觉功能缺陷加剧**

将幼鱼暴露于81 000 lx 8小时、40 000–50 000 lx或20 000–25 000 lx 6小时后，OKR缺陷分别加剧至38.4%、36.7%和31.7%的扫视频率降低，均显著高于标准光照条件下的20.7%降幅。40 000–50 000 lx处理6小时后11cRAL显著降低48.8%（p=0.0153），与标准光照下的降低幅度相近。免疫荧光显示高光照条件下光感受器标记物无变化。

**标准低光照条件下成年rgrb^?/?; rgra^?/?斑马鱼11cRAL水平无显著差异**

成年斑马鱼于标准低光照（137 lx）或暗适应24小时后，rgrb^?/?; rgra^?/?双敲除与WT间11cRAL水平无显著差异。但双敲除在光照适应条件下atROL水平显著升高（p=0.0132），暗适应条件下atRP水平较单敲除显著变化。

**成年rgrb^?/?; rgra^?/?斑马鱼眼的蛋白质组学揭示ECM蛋白显著上调及布鲁赫膜胶原纤维组织紊乱**

无偏向性蛋白质组学分析检测到9 107个蛋白，其中179个差异表达（p<0.05，倍数变化>2），包括139个上调和40个下调蛋白。Rgra和Rgrb分别为下调最显著的蛋白（约72倍和30倍），验证了敲除效率。KEGG通路富集显示"肌肉细胞骨架"、"黏着斑"和"ECM-受体相互作用"等通路；基因本体（GO）分析揭示"细胞黏附"、"细胞-细胞黏附"、"ECM组织"等生物学过程及"钙离子结合"、"结构分子活性"、"肌动蛋白丝结合"等分子功能。 surprisingly，视觉循环相关蛋白变化极小，仅lratb.1上调约1.4倍、rpe65a下调约1.3倍；而ECM结构和组织相关蛋白显著上调，包括胶原α-1(XI)链异构体X1（3.03倍）、胶原α-1(XI)链（6.67倍）及胶原α-1(XII)链异构体X1（4.99倍）。

PSR染色结合偏振光显微镜显示，WT布鲁赫膜具有规则的梯状结构，侧向胶原纤维包围中央无纤维空间，垂直桥接纤维间隔3–10 μm；而双敲除显示更多量的紊乱胶原纤维填充了WT中特征性的胶原纤维间隙。胶原纤维计数显著增加（p=0.0355），但纤维宽度无显著差异（p=0.066）。SHG显微镜进一步证实了布鲁赫膜胶原纤维组织的紊乱。

## 讨论与结论

本研究首次在Rgr敲除模型中证明了视觉行为表型，并利用视锥细胞优势的斑马鱼模型深化了对RGR生物学功能的理解。rgrb^?/?; rgra^?/?双敲除幼鱼在明视觉条件下表现出降低的视动反应、减少的11cRAL水平，以及布鲁赫膜胶原纤维组织的紊乱，这些表型在更高光照强度下加剧，但在暗适应条件下消失，充分证明了RGR的光依赖性作用。

研究人员讨论了rgra和rgrb在RPE和Müller胶质细胞中的保守共表达模式，这与全基因组复制后常见的亚功能化表达模式不同，提示存在独特的进化需求以维持功能冗余性。成年双敲除在低光照条件下未显示11cRAL降低，这与环境光照水平低于幼鱼饲养条件相关，与先前Rgr^?/?小鼠在140 lx下无11cRAL变化的研究一致。 proteomic分析意外发现ECM蛋白显著上调而非视觉循环蛋白的广泛紊乱，提示RGR缺失可能通过RPE和Müller胶质细胞的细胞应激、炎症反应、TGF-β激活及上皮-间质转化等途径导致胶原过度产生。

研究结论指出，该研究首次证明RGR敲除模型的视觉行为表型，该功能表型具有光依赖性并与视觉循环生色团11cRAL的显著降低伴随；无偏向性蛋白质组学揭示视觉循环蛋白表达变化甚微，而ECM蛋白显著增加；组织学分析确定布鲁赫膜中胶原水平显著升高，布鲁赫膜是脉络膜血供与RPE之间的ECM丰富结构，其完整性丧失与IRD和AMD进展相关。综上所述，本研究利用斑马鱼模型证明了RGR在维持视锥细胞介导明视觉中的关键作用，揭示了RGR在明视觉循环中的核心功能，并发现了RGR维持布鲁赫膜完整性的新作用。