细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）耗竭通过p38/COX2信号通路增加FK866诱导的人脐静脉内皮细胞衰老样状态中的前列腺素类物质生成

《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Intracellular NAD+ Depletion Increases Prostanoid Production via p38/COX2 Signalling in FK866-Induced Senescent Human Umbilical Vein Endothelial Cells

　　

血管内皮细胞通过释放具有血管收缩和血管舒张效应的介质维持血管稳态。前列腺素类物质（prostanoids）是由环氧合酶2（COX2）合成的生物活性物质，其在维持血管功能的同时，也可能增加与衰老相关的心血管疾病（CVD）风险。年龄相关的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）下降已被认为参与CVD的发病过程。然而，血管内皮细胞内NAD⁺水平与前列腺素类物质生成之间的关系尚不明确。本研究显示，细胞内NAD⁺水平降低可通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，上调COX2蛋白表达，并增加人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中前列腺素F1α（PGF1α）和血栓烷B₂（TXB₂）的生成。采用烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）抑制剂FK866处理后，细胞内NAD⁺水平下降，诱导出一种以细胞增殖受抑而无细胞死亡为特征的细胞衰老样表型，并促进HUVECs中PGF1α和TXB₂的生成。FK866处理提高了磷酸化p38和COX2蛋白水平，而给予p38抑制剂PD169316则抑制了FK866所致的COX2表达升高。在FK866处理后补充作为NAD⁺前体的烟酰胺单核苷酸（NMN），可恢复细胞内NAD⁺水平，减轻细胞衰老样表型，并削弱PGF1α和TXB₂的生成。上述结果提示，在急性耗竭条件下，细胞内NAD⁺似乎参与调控HUVECs中的前列腺素类物质生成。

该文发表于《Journal of Cellular and Molecular Medicine》，围绕血管老化背景下内皮代谢失衡与脂质炎症介质异常生成之间的联系展开研究。血管内皮细胞位于血管腔面的最内层，不仅承担屏障功能，还通过释放多种血管活性介质调控血管张力与稳态。前列腺素类物质（prostanoids）来源于花生四烯酸-环氧合酶（COX）代谢轴，其中前列环素（PGI₂）与血栓烷A₂（TXA₂）是心血管系统中两类关键效应分子，分别主要介导舒血管与缩血管作用。既往研究提示，随年龄增长，血管内皮及平滑肌细胞中前列腺素生成相关酶及其受体表达异常升高，这种失衡可能成为心血管疾病（CVD）风险上升的重要机制之一。另一方面，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）作为细胞氧化还原反应和信号调控的核心辅酶，其含量在衰老过程中下降已得到动物和人群研究支持。尽管NAD⁺补充对血管功能具有保护作用，但细胞内NAD⁺下降是否足以直接驱动内皮细胞前列腺素类物质过量生成，仍缺乏清晰证据。基于此，研究人员以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为模型，检验急性NAD⁺耗竭对内皮衰老样改变及前列腺素类生成的影响，并解析其分子机制。

在方法学上，研究采用商业来源并在伦理许可下获得的HUVECs进行体外实验。通过NAMPT抑制剂FK866诱导细胞内NAD⁺耗竭，使用NAD⁺/NADH定量检测细胞内NAD⁺变化；采用qPCR检测p21与p16转录水平，Western blot检测Lamin B1、COX2、磷酸化p38及总p38蛋白；通过SA-β-gal染色与EdU掺入实验评价衰老样表型和增殖能力，并用PE-Annexin V/7-AAD流式细胞术评估细胞死亡；以ELISA检测PGF1α和TXB₂水平；进一步结合COX2抑制剂celecoxib、p38抑制剂PD169316及NAD⁺前体NMN进行干预验证。

研究结果部分可概括如下。

3.1 FK866 Treatment Decreases Intracellular NAD⁺ Levels and Induces Senescence-Like Phenotype in HUVECs
研究人员首先确认FK866是否能够有效降低HUVECs内NAD⁺水平。结果显示，2.5 nM FK866使细胞内NAD⁺呈时间依赖性下降，4 h后即达到统计学显著，48 h时下降至基线的1.5%。在此基础上，研究进一步评估衰老标志。qPCR结果显示，p21 mRNA在处理1 h和2 h后显著升高，而p16 mRNA在48 h内未被诱导。蛋白和表型检测显示，FK866处理48 h显著降低Lamin B1蛋白表达，并显著增加SA-β-gal阳性细胞比例。上述结果表明，急性NAD⁺耗竭可促使HUVECs向衰老样表型转变。

3.2 FK866 Treatment Suppresses Proliferation Without a Detectable Increase in Cell Death in HUVECs
为区分衰老样改变与细胞死亡，研究人员采用EdU掺入及Annexin V/7-AAD双染流式分析。EdU结果显示，对照组EdU阳性细胞比例为42.1%，FK866处理组降至7.8%，提示S期DNA合成显著受抑，细胞增殖能力明显下降。与此同时，FK866处理48 h并未显著改变坏死、晚期凋亡、早期凋亡及存活细胞各亚群比例；而阳性对照放线菌素处理则显著增加凋亡细胞比例。该结果说明，在本实验条件下，FK866主要造成细胞增殖抑制而非明显诱导凋亡或坏死，这与衰老样而非细胞毒性终末损伤相一致。

3.3 FK866 Treatment Increases PGI₂ and TXA₂ Production by Upregulating COX2 Protein Expression in HUVECs
围绕前列腺素类生成这一核心问题，研究检测了PGI₂和TXA₂的稳定代谢产物PGF1α与TXB₂。结果显示，FK866处理48 h后，培养上清中PGF1α和TXB₂水平均显著升高，同时COX2蛋白表达显著上调。进一步给予选择性COX2抑制剂celecoxib后，FK866诱导的PGF1α和TXB₂升高被抑制。由此可见，NAD⁺耗竭可通过上调COX2，增强HUVECs中PGI₂和TXA₂相关产物生成。

3.4 FK866 Treatment Increases COX2 Protein Expression by Activating the Stress-Responsive p38 MAPK Pathway in HUVECs
为解析COX2上调的上游机制，研究人员考察了多个经典炎症与应激信号通路。结果显示，FK866并未诱导NF-κB转录活性亚基p65的磷酸化；在ERK、JNK和p38三条MAPK通路中，仅p38磷酸化显著升高，而ERK和JNK未见明显变化。药理学验证显示，p38抑制剂PD169316可显著抑制FK866诱导的COX2表达，另外两种结构不同的p38抑制剂BIRB796和PH-797804亦得到一致结果。进一步在p38α siRNA下调背景中，FK866不再显著诱导COX2升高。相反，celecoxib不能反馈影响p38磷酸化。由此可见，FK866诱导的COX2上调位于p38 MAPK激活之后，提示NAD⁺耗竭通过p38/COX2轴促进前列腺素类生成。

3.5 Restoration of Intracellular NAD⁺ Levels by NMN Suppresses FK866-Induced Cellular Senescence in HUVECs
为证明上述改变确由NAD⁺耗竭驱动，研究人员使用NAD⁺前体NMN进行补充。FK866处理48 h后，在最后24 h联合给予50或100 μM NMN，可将细胞内NAD⁺分别恢复至基线的44%和68%。功能上，100 μM NMN可显著抑制FK866导致的Lamin B1下降，而50和100 μM NMN均可显著减少SA-β-gal阳性细胞比例。这说明FK866诱导的衰老样表型至少部分由细胞内NAD⁺下降介导，补充NMN能够缓解这一过程。

3.6 Restoration of Intracellular NAD⁺ Levels by NMN Suppresses FK866-Induced PGI₂ and TXA₂ Production via the p38/COX2 Pathway in HUVECs
研究进一步检验NAD⁺恢复是否能够逆转p38/COX2激活及前列腺素类生成增加。结果表明，在FK866暴露末24 h联合NMN处理，可显著抑制磷酸化p38升高与COX2表达上调，并同步显著抑制PGF1α和TXB₂生成增加。该部分结果构成了因果链条的关键证据，即前述分子与功能改变并非FK866的非特异效应，而主要归因于细胞内NAD⁺耗竭本身。

讨论部分指出，本研究的重要贡献在于证明：在HUVECs中，急性且显著的NAD⁺耗竭足以诱导衰老样表型，并通过p38 MAPK/COX2信号轴增强前列腺素类物质生成。作者强调，本研究所用FK866使NAD⁺下降至基线的1.5%，其幅度强于生理性衰老；相对而言，NAMPT siRNA仅使总NAD水平降至54.8%，并未引起SA-β-gal阳性细胞增加或COX2上调，因此研究提示，轻度NAD⁺下降未必足以触发该反应，而严重耗竭更可能驱动内皮细胞进入衰老样状态并促进COX2来源前列腺素类生成。作者还讨论了本研究与既往FK866抑制p38活化报道的差异，提出在内皮细胞环境中，NAD⁺耗竭可能通过诱导氧化应激激活p38，但该机制尚待进一步验证。就血管理论意义而言，PGI₂与TXA₂通常协同生成并相互制衡，维持血管张力稳态；本研究观察到两者相关代谢物同时升高，且前列环素合酶与血栓烷合酶表达并未增加，提示变化主要来自上游COX2增强。由于长期选择性COX2抑制存在心血管不良事件风险，直接抑制COX2并非理想长期策略；相比之下，通过NMN恢复NAD⁺稳态，同时下调p38/COX2信号并减轻前列腺素类异常升高，提示NAD⁺补充可能成为调控血管老化相关炎症及内皮功能障碍的替代思路。

本研究也指出其局限性：模型仅限于体外HUVECs，不能完全代表体内血管环境；NAD⁺耗竭由FK866药理性急性诱导，未必等同于衰老中的慢性渐进性下降；未考察长期NAD⁺前体补充，也未评估白三烯（LTs）和脂氧素（LXs）等其他脂质介质；此外，尚缺乏血管舒张功能或血小板聚集相关等功能性读出。尽管如此，研究结果仍明确支持细胞内NAD⁺稳态是调节内皮COX2依赖性前列腺素类生成的重要因素。

研究结论可译为：本研究结果提示，在急性耗竭条件下，细胞内NAD⁺似乎参与调控HUVECs中的前列腺素类物质生成。更具体而言，NAD⁺耗竭通过激活p38 MAPK并上调COX2，促进PGF1α和TXB₂生成，同时诱导以内皮细胞增殖抑制为特征的衰老样表型；补充NMN可恢复NAD⁺水平并逆转这些变化。整体上，该研究为理解衰老相关血管功能障碍的代谢炎症机制提供了实验依据，并为基于NAD⁺稳态干预的潜在治疗策略提供了支持。