Gremlin-1通过促进内皮分化与血管生成驱动肿瘤血管形成

《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Gremlin-1 Drives Tumour Vascularization by Promoting Endothelial Differentiation and Angiogenesis

　　

Gremlin-1是一种骨形态发生蛋白(BMP)信号通路的分泌型拮抗剂，在多种恶性肿瘤中高表达并与不良预后密切相关。除其已被证实的促血管生成活性外，其在肿瘤背景下对内皮分化的潜在作用尚未完全明确。本研究旨在探究Gremlin-1是否通过同时促进内皮分化与血管募集参与肿瘤血管形成。研究发现，Gremlin-1在小鼠胚胎干细胞(ESCs)中的表达可在体外促进富含中胚层与内皮谱系的肿瘤样结构发育，表现为谱系特异性标志物上调及CD31阳性血管样网络形成。在体内，Gremlin-1表达的ESCs生成的畸胎瘤体积更大，伴有显著的基质扩张及血管密度增加，同时仍保留多谱系分化能力。利用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验区分供体来源的血管发生与宿主驱动的血管生成，结果显示Gremlin-1表达的移植物生长加快且血管化程度更高。物种特异性内皮标记显示，血管结构中同时存在ESC来源与宿主来源的内皮细胞。综上，本研究确定Gremlin-1是组织血管形成的调控因子，可整合内源性内皮分化与外源性血管生成反应，该机制可能与包括肿瘤生长在内的多种病理状态下的血管重塑相关。

本研究发表于《Journal of Cellular and Molecular Medicine》，针对分泌型骨形态发生蛋白(BMP)拮抗剂Gremlin-1在肿瘤血管化中的作用机制展开深入探索。既往研究已证实Gremlin-1在胃癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤及乳腺癌等多种恶性肿瘤中高表达，可通过抑制BMP驱动的分化维持祖细胞样状态以促进肿瘤发生，还可通过直接激活血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)、成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)及与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用发挥不依赖BMP的促血管生成活性，但这些作用多被归因于内皮细胞激活与出芽性血管生成。目前尚不清楚Gremlin-1是否会影响内皮谱系定向，从而在血管生成上游层面参与血管形成，这也是本研究试图解决的核心科学问题。

研究人员构建了稳定过表达Gremlin-1的小鼠胚胎干细胞(ESC^gremlin)系，结合体外肿瘤样结构(tumoroid)形成实验、小鼠皮下畸胎瘤模型及鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)移植模型，从细胞分化、体内成瘤及血管来源解析三个层面系统探究Gremlin-1的功能。研究结果表明，Gremlin-1通过双重机制驱动肿瘤血管化：一方面促进多能干细胞向内皮谱系定向分化，另一方面增强宿主血管的招募，二者共同加速肿瘤生长。该研究首次揭示了Gremlin-1在内皮分化中的调控作用，拓展了对其促血管活性的认知，为靶向肿瘤血管形成的联合治疗策略提供了新的潜在靶点。

关键技术方法方面，研究采用三种核心模型：一是体外ESC分化体系，通过悬滴法构建肿瘤样结构，结合流式细胞术与免疫荧光评估内皮分化；二是免疫缺陷小鼠皮下畸胎瘤模型，比较ESC^wt与ESC^gremlin的成瘤能力与血管密度；三是鸡胚CAM移植模型，利用物种特异性内皮标记区分供体来源血管发生与宿主来源血管生成。分子检测层面采用qRT-PCR分析谱系标志物表达，Western blot验证蛋白表达，免疫组化定量血管面积。

研究结果如下：

3.1 Gremlin调控干性相关转录因子的表达

在白血病抑制因子(LIF)存在下，Gremlin-1过表达不影响ESC增殖与未分化状态。撤除LIF诱导分化后，两组细胞的干性标志物Oct4、Sox2、Nanog均随时间下降，但ESC^gremlin细胞保留了更高的Oct4与Sox2水平，提示Gremlin-1改变了多能性退出的动力学，延缓干性丢失。

3.2 Gremlin增强中胚层定向与内皮分化

体外肿瘤样结构实验中，ESC^gremlin来源的样本显著上调Wnt7a、Wnt7b、CD45及αSMA等中胚层标志物，同时选择性增强CD31、CD34、VE-钙黏蛋白(VE-Cad)及FLK1等内皮标志物表达。形态学分析显示ESC^gremlin肿瘤样结构形成更广泛、致密且相互连接的CD31富集血管样网络。流式细胞术证实CD31⁺/VEGFR2⁺双阳性细胞比例显著增加。三维共聚焦重建显示ESC^gremlin来源CD31⁺细胞中未成熟内皮祖细胞标志物Nestin表达降低，提示内皮分化更为成熟。

3.3 Gremlin增加畸胎瘤血管化

在NOD/SCID小鼠皮下成瘤实验中，ESC^gremlin来源的畸胎瘤生长更快、体积与重量均显著增加。组织学分析证实两组均保留三胚层分化能力，但ESC^gremlin组富含中胚层来源组织，间质成分扩张且血管化区域增加。qPCR与免疫荧光结果一致显示内皮标志物CD31、Flk1及VE-钙黏蛋白表达上调，且可见大量结构完整的血管样结构，同时存在无明确管腔结构的CD31⁺细胞簇，提示存在内皮祖细胞或早期分化阶段。

3.4 Gremlin同时诱导血管发生与血管生成

利用鸡胚CAM模型可区分鼠源ESC分化产生的内皮细胞与禽源宿主招募的内皮细胞。ESC^gremlin移植物生长加速且体积更大，组织学显示血管密度更高。qPCR检测到鼠源中胚层与内皮标志物持续高表达，证实ESC向内皮谱系分化增强。物种特异性共染色显示禽源von Willebrand因子(FVIII)阳性宿主内皮细胞增多，且与鼠源血小板内皮细胞黏附分子1(PECAM1)阳性细胞紧密相邻，表明Gremlin-1同时促进供体来源血管发生与宿主来源血管生成。

讨论部分指出，本研究将Gremlin-1的促血管功能从单纯的内皮细胞激活拓展至谱系命运调控层面。Gremlin-1可能通过双重机制发挥作用：作为BMP拮抗剂抑制分化以维持祖细胞状态，同时作为配体激活VEGFR2或FGFR1促进内皮分化与存活。这种双重调控解释了Gremlin-1表达与肿瘤进展、血管重塑的强相关性。尽管具体信号通路的相对贡献尚需进一步解析，但本研究为靶向Gremlin-1或其下游通路提供了理论基础——联合抑制内皮分化与宿主血管招募或可克服现有抗血管生成治疗的耐药问题。研究结论最终确认Gremlin-1是肿瘤血管化的双重调控因子，通过整合血管发生样过程与经典血管生成反应，在肿瘤微环境中塑造功能性血管网络。