《Microbial Pathogenesis》：A novel cyclic antimicrobial peptide N1-7567 targets Campylobacter jejuni through membrane disruption and metabolic disruption
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空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是一种重要的食源性病原体，常与禽类食品相关，构成全球公共卫生潜在威胁。研究人员从一株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）中鉴定出一种由非经典小开放阅读框（ORF）编码的新型环状抗菌肽
空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是一种重要的食源性病原体，常与禽类食品相关，构成全球公共卫生潜在威胁。研究人员从一株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）中鉴定出一种由非经典小开放阅读框（ORF）编码的新型环状抗菌肽N1-7567，其氨基酸序列为AFLKRFSCRLIRAGKYLSCLLQPAA，并通过两个半胱氨酸残基之间的二硫键形成环状构象。N1-7567对空肠弯曲菌的最小抑菌浓度（MIC）为64 μg/mL。研究表明，N1-7567可与细菌膜结合，破坏膜完整性，并进入细胞质，引发一氧化氮（NO）释放、活性氧（ROS）积累、三磷酸腺苷（ATP）泄漏，并直接与细菌基因组DNA相互作用，共同抑制细菌生长。值得注意的是，N1-7567显著降低了大蜡螟（Galleria mellonella）的感染死亡率。这些结果凸显N1-7567作为控制空肠弯曲菌感染与传播候选分子的潜力。
研究背景
空肠弯曲菌（C. jejuni）是全球范围内重要的食源性致病菌，严重感染可引发格林-巴利综合征（GBS）。该菌广泛存在于家禽及畜产品，给公共卫生与经济带来沉重负担。长期滥用传统抗生素导致多重耐药（MDR）空肠弯曲菌的出现，削弱了现有治疗手段。抗菌肽（AMPs）因多靶点作用机制而被视为替代抗生素的重要候选分子。环状抗菌肽因其结构稳定、活性多样成为研究热点，但其针对空肠弯曲菌的作用机制仍不清楚。本研究由海南师范大学等单位完成，发表于《Microbial Pathogenesis》。
主要技术方法
研究人员采用基因组挖掘策略，从地衣芽孢杆菌中筛选非经典小ORF，并利用CAMPR4与APD3数据库预测抗菌潜力。通过AlphaFold3进行三维结构预测，圆二色谱（CD）分析二级结构，合成FITC标记肽用于细胞定位。采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC），时间-杀菌动力学评估杀菌速率，分子动力学（MD）模拟肽与膜相互作用。通过流式细胞术、透射电镜（TEM）、扫描电镜（SEM）观察膜损伤，检测ATP、ROS、NO水平变化，DNA凝胶阻滞实验验证DNA结合能力，并在大蜡螟感染模型中评估体内保护效果。
研究结果
3.1 筛选、鉴定与合成N1-7567
通过基因组ORF预测与数据库筛选，获得含二硫键的小肽N1-7567，其分子量约2827 Da，纯度超过95%。CD光谱显示其在膜模拟环境中呈α-螺旋与无规卷曲混合构象，且240 nm附近负峰可能与二硫键有关。
3.2 N1-7567的抗菌活性
N1-7567对空肠弯曲菌81-176的MIC为64 μg/mL，并对不同来源及ST型菌株均保持活性，包括多重耐药株。其对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌亦具中等抑制作用。时间-杀菌曲线显示2×MIC处理4小时可使活菌数下降4.72 log单位，PI染色证实膜通透性显著增加。
3.3 穿透细菌膜及细胞内定位
FITC标记肽实验表明N1-7567可进入胞质，TEM与SEM显示膜变薄、破裂及胞质紊乱。磷脂竞争实验发现阴离子磷脂PG与CL可削弱其活性，MD模拟揭示肽通过静电作用与膜结合并插入脂质双层，形成稳定氢键网络。
3.4 扰乱胞内稳态并与DNA相互作用
DNA凝胶阻滞与分子对接证实N1-7567以浓度依赖方式结合基因组DNA。处理后细胞外ATP显著升高，胞内ROS与NO水平上升，ONPG实验进一步证实膜通透性增加。
3.5 安全性与治疗潜力
N1-7567在50与100 μg/mL浓度下溶血率低于5%，对人结肠腺癌Caco-2细胞无明显毒性。大蜡螟模型显示2×MIC处理显著提高幼虫存活率，生存率提升37.78%。
讨论与结论
N1-7567是由非经典ORF编码的环状抗菌肽，通过静电作用优先结合阴离子膜脂，破坏膜完整性并进入胞内，直接结合DNA，引起ATP泄漏、ROS与NO积累，从而抑制空肠弯曲菌生长。该肽对多重耐药株有效，且在动物模型中表现出良好的体内保护效果与安全性，有望作为食源性空肠弯曲菌防控的新候选分子。未来可通过序列优化或联合用药策略进一步提升其广谱抗菌潜力。
