有限血浆体积下液体活检蛋白质组学的方法学评估

《Molecular & Cellular Proteomics》：Method evaluation of liquid biopsy proteomics for limited plasma volume

　　

血浆蛋白质组学的一个主要挑战在于降低血浆蛋白的动态范围，以捕获低丰度蛋白的表达。虽然免疫亲和去除高丰度蛋白和邻近延伸分析(proximity extension assay, PEA)在人类样本中广泛应用，但在非临床评估的动物物种中应用仍然有限。本研究使用健康及2型糖尿病模型大鼠各20 μL血浆，对Mag-Net和ENRICH-iST两种方法进行评价。结合优化的液相色谱-串联质谱(LC-MS)方法，Mag-Net鉴定到的蛋白数量多于ENRICH-iST，且精度更高，尽管两种方法均鉴定到超过5,000种蛋白。通过整合蛋白质组学和分析手段，包括细胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)数据库比较、基因本体(Gene Ontology, GO)分析、Simple Western、纳米颗粒追踪分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)以及污染评估，研究人员证明在大鼠血浆中，Mag-Net优先富集EV蛋白，而ENRICH-iST则较均衡地捕获包括EV蛋白在内的低丰度蛋白。无论采用何种富集方法，半数以上的组织特异性蛋白被归类为肝脏或脑组织特异。其中，一些参与蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)的肝脏特异性蛋白，如Proz/Serpina10和Ambp/Itih1/Itih2，在Mag-Net方法中的平均定量值比ENRICH-iST高出十倍以上，提示PPI网络的富集增强。通路分析(Ingenuity Pathway Analysis, IPA)显示，Mag-Net数据集中有219个下调蛋白和80个上调蛋白(倍数变化≥1.5，pBH≤0.05)，ENRICH-iST数据集中则有68个下调蛋白和43个上调蛋白(倍数变化≥1.5，pBH≤0.2)。一些显著下调的通路，如弹性纤维形成，仅在Mag-Net方法中被识别。该方法被证明是研究失调蛋白和通路的强有力工具，潜在应用包括生物标志物发现及药物研发过程中的疗效与安全性评估。

该研究发表于《Molecular》。血浆蛋白质组学作为一种无创液体活检技术，具有在非临床和临床试验中监测组织水平变化的潜力。然而，血浆中高丰度蛋白的广泛动态范围限制了低丰度蛋白的检测，传统免疫亲和去除方法存在物种适用性受限、成本高、目标蛋白易丢失等问题。同时，非临床动物实验往往可用血浆体积有限，通常不足50 μL，这对方法灵敏度提出了更高要求。为此，研究人员针对仅需少量血浆且跨物种通用的Mag-Net与ENRICH-iST富集方法进行了系统比较。

研究中，研究人员使用12周龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠作为健康对照，Zucker Diabetic Fatty(ZDF)大鼠作为2型糖尿病模型，每组各三只生物学重复，血浆体积均为20 μL。关键技术方法包括：Mag-Net法利用强阴离子交换磁珠(MagReSyn SAX)富集膜相关颗粒，ENRICH-iST法通过理化方式富集低丰度蛋白；样品经酶解后，采用数据非依赖采集(Data-Independent Acquisition, DIA)模式进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析；数据分析使用DIA-NN软件并结合基因本体(GO)、Ingenuity Pathway Analysis(IPA)、String蛋白互作网络分析等生物信息学工具；辅以Simple Western检测EV标志蛋白，纳米颗粒追踪分析(NTA)测定颗粒浓度与粒径分布，以及基于血细胞标志蛋白的污染评估。

优化Mag-Net流程

研究人员首先针对20 μL血浆优化了Mag-Net流程，发现过夜胰蛋白酶消化可在减少漏切位点的同时提高蛋白鉴定数，并获得最低中位数变异系数(CV=6.83%)，因此选为该研究主流程条件。

Mag-Net与ENRICH-iST技术比较

在SD和ZDF大鼠血浆中，Mag-Net共鉴定5,915种蛋白，ENRICH-iST鉴定5,561种，重叠蛋白4,926种。ExoCarta前100种EV蛋白中有88种被两种方法共同检出，表明结果反映了EV相关内容。Mag-Net的定量重复性优于ENRICH-iST，中位数CV分别为15.7%(SD)和10.3%(ZDF)，ENRICH-iST为约24%。GO分析显示，共有蛋白多与蛋白运输及结合相关；Mag-Net独有蛋白未显著富集特定功能，ENRICH-iST独有蛋白则富集于胞外区域及胞外基质组织。相对排名分析显示，Mag-Net更倾向于富集EV蛋白，ENRICH-iST对低丰度蛋白的捕获更均衡。

组织特异性蛋白富集

两种方法均检测到三百余种组织特异性蛋白，半数以上为肝脏或脑特异。部分肝脏特异性PPI相关蛋白在Mag-Net中定量值显著高于ENRICH-iST，提示其更适合研究组织来源的EV蛋白。

纯度评估

污染指数分析显示血小板标记信号最高，红细胞标记在Mag-Net中排名更低，表明其红细胞污染较少。Simple Western证实EV标志蛋白Cd63、Cd81、Tsg101在Mag-Net样品中存在，Flot1在去血小板血浆中消失，支持其为EV来源而非完整细胞污染。NTA结果显示Mag-Net显著富集小EV，颗粒浓度达7.45×10¹¹particles/mL，平均粒径94 nm。

ZDF大鼠的失调通路

IPA分析显示，Mag-Net数据集中共鉴定299个差异蛋白，ENRICH-iST为111个。所有显著差异通路均为下调，弹性纤维形成和整合素细胞表面相互作用等通路仅在Mag-Net中被识别，胶原生物合成等通路两者均检出。

短梯度Orbitrap Astral与长梯度Orbitrap Fusion Lumos比较

短梯度Astral平台在42.6分钟梯度下可鉴定约90%的长梯度Lumos蛋白，显著提高通量。

讨论部分指出，Mag-Net在覆盖度与重现性方面优于ENRICH-iST，主要得益于单管操作的样品制备减少了损失，以及过夜消化降低了批间变异。EV富集得到多重验证，且血小板来源EV背景在研究糖尿病时可能是有意义的生物学信号。污染评估未发现系统性偏倚，确保了差异蛋白分析的可靠性。研究还指出，Mag-Net能有效捕获肝、脑等组织的特异性蛋白变化，并在2型糖尿病模型中识别了以往未在血浆中报告的弹性纤维形成通路下调。

研究结论为，Mag-Net方法在使用仅20 μL大鼠血浆时，提供了更深层次的蛋白质组覆盖与更高的定量精度，尤其适用于小体积血浆的EV相关研究，在非临床药物评价和生物标志物发现中具有广阔应用前景。