病原菌分泌的长链非编码RNA通过螯合宿主microRNA发挥致病作用

《Nature》：A pathogen lncRNA secreted into rice sequesters a host miRNA for virulence

　　

植物与动物通过模式识别受体（Pattern Recognition Receptor, PRR)和Nod样受体（Nod-like Receptor, NLR)蛋白感知病原菌。病原菌通常利用蛋白效应子抑制宿主免疫以实现成功侵染。然而，非蛋白效应子类别的存在相对研究不足。本研究报告了一种调控RNA编码DNA序列通过分别产生两条互补调控RNA来介导病原菌-宿主互作的RNA-RNA识别机制。具体而言，稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中从该DNA区域转录而来的长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）转移至宿主水稻细胞中，并螯合源自不同宿主DNA区域的互补microRNA（miRNA），从而颠覆宿主免疫。反过来，该水稻来源的miRNA通过抑制编码宿主免疫负调控因子PKR1 (Pyruvate Kinase Receptor 1)的表达来促进抗病性。真菌lncRNA对宿主miRNA的螯合解除了对PKR1表达的抑制，从而促进真菌侵染。研究人员发现该调控RNA编码DNA序列可能广泛存在于多种生物物种中，介导病原菌与其植物宿主之间的互作。综上所述，研究人员的发现为利用源自这一重要DNA区域的miRNA进行有效病害防控提供了新途径。

病原菌与宿主的互作是自然界中的基本生物学过程。植物依赖细胞表面模式识别受体和细胞内Nod样受体（NLR)检测病原菌信号，而动物则结合类似的先天免疫途径与适应性免疫。大多数已知的免疫调控因子为蛋白编码基因，其中部分在物种间高度保守。病原菌分泌蛋白效应子以抑制宿主免疫，但关于DNA区域编码的其他非蛋白编码RNA是否参与宿主-病原识别及疾病结局尚不清楚。

研究人员选择严重危害水稻的稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）作为生物互作模型，系统探究lncRNA在真核生物病害进程中的潜在作用。通过RNA测序（RNA-seq)分析稻瘟病菌不同发育阶段，研究人员鉴定出lnc117761在侵染相关阶段表达最高。该lncRNA长度为1,589核苷酸，在150个不同M. oryzae菌株中保守存在。缺失突变体Δlnc117761的致病性较野生型菌株显著降低，表现为侵入菌丝发育缺陷，但生长、应激响应及附着胞形成正常。将lnc117761表观表达（epi-expression）于三个水稻品种后，转基因水稻对稻瘟病的感性显著增强。这些结果表明lnc117761作为效应子调控植物防御响应。

基于lncRNA常通过碱基配对与靶标结合的功能特性，研究人员预测水稻中7个源自非蛋白编码DNA区域的miRNA可能与lnc117761配对，其中miR5827匹配度最佳。miR5827前体以单拷贝基因形式存在，携带保守的21核苷酸基序，在480个具有高质量基因组序列的水稻品种中289个品种中存在。野生型菌株侵染显著抑制miR5827表达，而Δlnc117761突变体则不能，表明lnc117761参与调控水稻miR5827水平以影响致病性。lnc117761的3'端可与miR5827形成15个Watson-Crick碱基对及1个非标准摆动（U:G）碱基对。电泳迁移率变动分析（EMSA)证实生物素标记的miR5827与lnc117761中miR5827结合位点（MBS_lnc117761）结合，但不与突变位点结合。该结合经本氏烟草（Nicotiana benthamiana）转激活实验、水稻原生质体荧光素酶实验及RNA pull-down验证。等温滴定量热法（ITC)测定miR5827与lnc117761的解离常数（K_d)为3.44 μM。进一步通过连接相互作用RNA（LIGR)偶联RT-qPCR证实lnc117761与miR5827在M. oryzae侵染水稻过程中存在杂交。

为验证MBS的生物学功能，研究人员构建了21核苷酸MBS缺失的lnc117761变体（lnc117761^ΔMBS）。该变体无法恢复Δlnc117761突变体的致病性，也不能抑制水稻中miR5827表达。对MBS进行16个核苷酸的定点突变，鉴定出9核苷酸核心基序（GUUGCAACA），该基序突变会削弱或消除与miR5827的结合及致病功能。

为阐明miR5827在稻瘟病抗性中的作用，研究人员构建了miR5827敲除（miR5827KO）和过表达（miR5827OX）转基因水稻。miR5827KO系表现出降低的稻瘟病抗性，而miR5827OX系则增强抗性，表明miR5827抑制M. oryzae的侵入生长。通过psRNATarget工具预测并结合RT-qPCR验证，研究人员鉴定出14个miR5827候选靶基因，其中Os05g07300（PKR1基因，编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体）在miR5827KO系中表达升高最为显著。EMSA、转激活实验、荧光素酶实验及ITC证实miR5827特异性结合PKR1 mRNA中的MBS（MBS_PKR1）。miR5827KO系中PKR1 mRNA水平升高，而miR5827OX系中降低，表明miR5827直接靶向PKR1抑制其表达。PKR1功能验证实验显示，PKR1敲除（PKR1KO）显著增强水稻对M. oryzae的抗性，而过表达（PKR1OX）则降低抗性，证实PKR1负调控植物病害抗性。lnc117761表观表达系中PKR1 mRNA水平显著高于野生型，而miR5827OX系中PKR1表达持续较低且不受侵染影响。Δlnc117761菌株在miR5827OX系上致病性丧失，但在miR5827KO系上显现部分致病性，表明lnc117761通过解除miR5827介导的PKR1抑制来促进侵染。

关于lnc117761向水稻细胞的转运机制，研究人员采用GFP标记的M. oryzae菌株侵染水稻组织，通过分离感染位点（样本1，含真菌菌丝）和周围未感染组织（样本2，不含真菌菌丝）进行分析。RT-qPCR证实lnc117761在36和48小时 post-inoculation (hpi)于两个样本中均可检测到，且样本2中的水平随接种孢子浓度增加而升高，而真菌参照基因在样本2中检测不到。原位杂交实验显示lnc117761探针在M. oryzae穿透位点、感染水稻细胞及相邻未感染细胞中均产生强信号，而非转运对照mRNA探针仅在真菌细胞中检测到信号。研究人员进一步从侵染菌丝培养上清中分离胞外囊泡，通过透射电镜、亲脂性染料染色和纳米颗粒追踪分析验证囊泡特性。RT-qPCR显示lnc117761在野生型Guy11胞外囊泡中高度富集。利用lnc117761-4×Pepper融合RNA追踪系统，研究人员在红色荧光标记的水稻细胞中观察到与真菌GFP绿色荧光明显分离的Pepper620信号，直接证实lnc117761向水稻细胞的转运。定量分析显示，转移至样本2的lnc117761至少占总量的27%，同时样本2中miR5827水平较Δlnc117761接种样本降低约50%，证实转运的lnc117761有效海绵化miR5827。

在种间保守性分析方面，研究人员以包含21核苷酸核心结合位点及两侧各5核苷酸的31核苷酸序列进行BLAST搜索，发现该结合位点在微生物和植物中广泛存在。704个微生物物种和76个植物物种中分别有16个核苷酸保守。随机序列置换对照实验显示原始同源序列的比特值显著高于 scramble 变体，证实该DNA区域的进化保守性。RT-qPCR检测表明大麦、拟南芥、马铃薯、短柄草和小麦等植物中均存在miR5827同源miRNA的表达。

在应用研究方面，研究人员发现水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）携带能产生靶向水稻miR5827的ncRNA的相似DNA序列。外源应用siRNA敲低该调控RNA后，R. solani致病性显著下降。miR5827KO水稻对纹枯病更感病，而miR5827OX水稻则更抗病，表明miR5827-PKR1模块在稻瘟病和纹枯病抗性中具有保守功能且不影响水稻农艺性状。对于小麦赤霉病（由Fusarium graminearum引起），研究人员鉴定了F. graminearum中相似DNA区域的RNA产物能配对小麦miR5827（Tamir5827）。化学合成的Tamir5827模拟物外部应用于小麦后，显著增强了对赤霉病的抗性，并促进了免疫相关基因TaPR1和TaPR10的表达。

讨论部分，研究人员总结指出该研究发现了由普遍存在的DNA区域调控的病原菌-宿主识别新机制：真菌lncRNA通过与互补宿主miRNA配对并抑制其功能来发挥作用。这与以往报道的双向转运小RNA作为跨界调控因子的机制不同，lnc117761代表了一种新的微生物跨界效应子形式，通过劫持水稻miR5827抑制宿主免疫。该调控RNA编码DNA序列的功能模式与常规PRR识别病原相关分子模式和NLR识别细胞内效应子的机制均不相同。研究人员同时指出，PKR1OX/TP309水稻对Δlnc117761突变体的抗性略高于野生型菌株，暗示miR5827-PKR1轴是主要但非唯一的作用机制，lnc117761可能还存在其他作用方式如海绵化其他植物miRNA、直接与植物蛋白互作或调控真菌自身致病过程。

该RNA-RNA识别介导生物互作的分子机制可能在多样物种中同步进化，作为一种入侵-防御策略，但此前未被报道。miR5827编码DNA序列位于水稻转座元件中，起源于稻属中的MuDR转座子。转座元件可促进miRNA进化并驱动调控RNA的发展，这可能解释了miR5827及其互补lncRNA序列在众多物种中广泛存在的原因。尽管生物信息学搜索尚未在该病原系统中鉴定到其他具有类似互补性的真菌lncRNA-宿主miRNA配对，但这种独特性可能由多种非互斥的进化情景解释。有效"海绵化"作用不仅需要序列互补性，还需要精确的时空表达、RNA稳定性及对接宿主RNA诱导沉默复合体（RISC)的可及性，这些严格的功能限制可能使此类功能配对较为稀少。

基因组中大量"暗物质"DNA区域可能执行着比先前理解更为关键的作用。该研究提供了广泛存在DNA区域在调控多样跨界生物互作中发挥广泛重要作用的首例，为解析更多保守DNA区域并揭示其神秘生物学功能开辟了范例。研究人员已成功利用合成miRNA有效防治作物病害，并指出通过鉴定miR5827等miRNA的优良等位基因或PKR1等靶基因的表达降低等位基因，将能够利用这些天然优良等位基因或通过先导编辑等先进技术获得的人工等位基因培育抗病作物。