星形胶质细胞糖皮质激素受体信号限制神经元可塑性

《Nature》：Astrocyte glucocorticoid receptor signalling restricts neuronal plasticity

　　

感觉经验在出生后发育的关键期（critical periods）完善神经回路。尽管已知神经元活动协调这一过程所依赖的回路布线，但随着动物成熟，限制发育可塑性的环境线索尚不明确。研究人员在此利用配对单细胞转录组学和染色质可及性测序，检验了小鼠初级视觉皮层（primary visual cortex, V1）在出生后发育过程中的经验依赖性成熟。除鉴定出在每个皮层细胞类型中出现的活动依赖性基因程序外，研究人员发现光照通过细胞类型特异性招募糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor, GR，由Nr3c1编码）至染色质，驱动星形胶质细胞成熟。星形胶质细胞GR信号激活一个广泛的基因调控程序，该程序在人类大脑发育中部分保守，并可能促进调节关键期关闭的成熟过程。综上所述，这些发现揭示星形胶质细胞GR信号限制神经元可塑性。糖皮质激素对星形胶质细胞成熟的调控可能也有助于早期生活压力对全脑的影响，且该过程的破坏可能增加对神经精神疾病的易感性。

神经回路在关键期（critical periods）适应早期生活经验，从而促进学习、记忆和行为。尽管成熟星形胶质细胞已被证明有助于这些关键期在跨物种中的关闭，但驱动星形胶质细胞成熟以限制神经元可塑性的具体因素仍不清楚。研究人员在此鉴定出GR作为星形胶质细胞成熟和发育可塑性的主调控因子。研究人员表明，在眼睛睁开时——这与啮齿类动物经典应激激素低反应期（stress hormone hyporesponsive period）的结束相对应——GR主要在星形胶质细胞中结合染色质，诱导一个广泛的基因表达程序，从而触发定义成熟星形胶质细胞身份的形态学变化。选择性破坏星形胶质细胞中的GR会诱导一种幼态持续（neotenic）状态，其特征为邻近小清蛋白（parvalbumin, PV）神经元上包绕神经元周围网（perineuronal nets, PNNs）减少、轴突可塑性基因重新激活，以及在成熟动物中重新开放经验依赖性可塑性。这些发现支持一个更广泛的模型：成年大脑保留了潜伏的幼年可塑性能力，这种能力可在星形胶质细胞GR信号所 enable 的结构制动被移除时被重新激活。结合研究人员发现的其他发育中脑区的星形胶质细胞GR依赖性基因调控，研究结果提示星形胶质细胞GR信号可能促进全脑的神经元回路成熟。

尽管神经元-星形胶质细胞通讯是主要的研究方向，研究人员的结果表明，星形胶质细胞接收血液来源因子也在大脑发育中发挥重要作用。光照可能改变其他循环激素的水平，这些激素反过来可能作用于星形胶质细胞以影响脑功能。需要进一步研究来理解星形胶质细胞如何整合外周和局部神经元来源信号以调节神经元网络和其他胶质细胞群。研究人员注意到，虽然星形胶质细胞 largely 缺乏性腺激素受体，但它们表达许多其他配体依赖性核受体，包括盐皮质激素、甲状腺激素、胰岛素和过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptors），这些受体可能对循环配体的变化产生反应以调节星形胶质细胞对脑内其他细胞类型的信号。

研究人员观察到GR基因组募集主要发生在星形胶质细胞中，尽管GR在大多数皮层细胞类型中均有表达，这值得重新审视关于脑内核受体基因组功能的长期假设。在这方面，研究人员推测星形胶质细胞可能是多种外周激素的主要靶点，通过包裹血管，星形胶质细胞可能缓冲其他细胞类型免受这些激素暴露，直到循环中该激素水平达到临界阈值。为此，此处使用的方法可能有助于表征在各种由高糖皮质激素水平定义的内部状态下，星形胶质细胞GR对神经元回路的驱动效应，包括禁食、睡眠紊乱和压力。

研究人员发现星形胶质细胞GR信号促进皮层成熟，这提出了早期生活压力——其增加皮质酮（corticosterone, CORT）产生并带来持久的神经精神疾病风险——可能破坏可塑性关键期的可能性。在这方面，检验早期生活压力是否通过激活星形胶质细胞GR而改变眼优势可塑性（ocular dominance plasticity, ODP）的关闭，以及 consequently，该途径的靶向基因或药理学抑制是否能阻断这些效应，将是重要的。支持这一可能性的是，近期研究表明早期生活压力通过星形胶质细胞GR信号作用于外侧下丘脑的神经元活动而扰乱神经元活动。鉴于该途径的特征在人类大脑发育中保守，研究人员预期该研究的结果可能具有治疗价值，同时进一步深化对大脑可塑性的理解。

研究人员开展了以下研究：利用配对单细胞转录组学和染色质可及性测序（simultaneous high-throughput assay for transposase-accessible chromatin (ATAC) and RNA expression with sequencing, SHARE-seq）分析正常饲养（normal-reared, NR）和黑暗饲养（dark-reared, DR）小鼠在五个年龄点（P7、P14、P21-P28、P35）的V1发育；通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）和液相色谱-质谱联用（liquid chromatography–mass spectrometry, LC–MS）测量血清激素；利用切割和运行（cleavage under targets and release using nuclease, CUT&RUN）技术结合星形胶质细胞特异性腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）标记进行GR全基因组结合分析；通过条件性基因敲除和形态学重建评估GR对星形胶质细胞成熟的影响；采用多重误差校正荧光原位杂交（multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization, MERFISH）验证；利用单核RNA测序（single-nucleus RNA-seq, snRNA-seq）和ATAC-seq分析跨细胞类型的效应；通过微量注射CORT和成年期AAV介导的GR敲除评估PNN动态；最后使用体内多电极阵列记录进行眼优势可塑性（ocular dominance plasticity, ODP）功能测定。

主要关键技术方法包括：SHARE-seq用于同时捕获单细胞转录组和染色质可及性；CUT&RUN用于低输入转录因子全基因组结合分析；MERFISH用于空间验证经验响应基因；条件性GR敲除（Astro-Cre AAV in GR^fl/fl mice）结合三维形态重建和多种测序技术；以及体内电生理记录ODP。

研究结果按以下小标题组织：

"Atlas of experience-dependent V1 development"：通过对70,907个细胞的SHARE-seq分析，研究人员鉴定了V1发育中 principal 皮层细胞类和亚型，发现视觉经验在兴奋性神经元（尤其L2/3）和非神经元细胞（包括星形胶质细胞）中引发广泛的基因表达和染色质状态变化。经验依赖效应的时间与V1发育关键阶段对齐：兴奋性和抑制性神经元在P21（关键期开始）和P35（关键期关闭）对视觉剥夺反应最强，而胶质细胞反应在P28达峰。约40%的基因变化为多细胞类型共享（包括即刻早期基因如Fosl2、Egr1和Nr4a1），其余为细胞类型特异性变化，编码细胞表面和分泌蛋白以协调V1回路布线。MERFISH验证了一些经验响应基因。染色质可及性分析揭示AP-1（FOS-JUN）结合基序为几乎所有细胞类型中 top 的经验诱导基序，同时鉴定了细胞类型特异性的转录因子，如小胶质细胞中的SPI1、PV抑制性神经元中的ESRRG、深层兴奋性神经元中的TBR1和SST抑制性神经元中的MAF。

"Light-dependent GR genomic recruitment in astrocytes"：与其他细胞类型不同，GR和盐皮质激素受体以及核因子I（nuclear factor I, NFI）的结合基序作为星形胶质细胞中 top 的视觉经验诱导调控位点出现。研究人员发现，眼睁开时（P14）NR小鼠血清CORT水平升高，而DR减弱此效应。通过星形胶质细胞特异性AAV表达核膜靶向GFP（eGFP-KASH），结合CUT&RUN，检测到6,274个光诱导GR结合位点，包括经典GR靶基因Mt1和Mt2，以及星形胶质细胞特异性位点如Aldoc和Cables1。GR敲除（GR-KO）显著减弱这些位点的GR募集。与其他V1细胞类型相比，星形胶质细胞中GR结合位点数量显著更多。GR与NFIA在星形胶质细胞中广泛共定位，且GR可与NFIA和LHX2共免疫沉淀。

"GR regulates postnatal astrocyte maturation"：敲除星形胶质细胞GR减少P21时星形胶质细胞领地体积和神经纤维网浸润。RNA-seq鉴定了数百个发育过程中受GR调控的基因，包括Aldh1a1、Ezr、Fam107a和Gjb6等成熟标志物。约50%的发育调控基因程序受GR诱导或抑制。GR激活位点主要含GR结合基序；GR抑制位点富含ZBTB转录因子基序，Zbtb16作为最下调的抑制因子出现。与其他小鼠脑区（纹状体、丘脑、前额叶皮层、运动皮层）的比较显示GR调控基因高度重叠。人类大脑发育分析显示，GR基序在第三孕期开始可及性增加，且多个进化保守的GR调控基因（如ETNPPL和GJB6）在人类星形胶质细胞成熟中表达 progressive 升高。

"Astrocyte GR promotes neural circuit maturation"：星形胶质细胞GR敲除导致细胞外基质（extracellular matrix, ECM）组织相关基因双向重编程，上调不成熟糖蛋白基因（Tnc、Vcan）和ECM降解金属蛋白酶基因，下调成熟ECM因子。P35时PV神经元上PNN密度降低，PV表达减少但PV神经元数量不变。P14时外源性CORT递送可部分恢复DR小鼠的PNN水平。成年期星形胶质细胞GR敲除也降低PNN和聚集蛋白聚糖（aggrecan）。此外，星形胶质细胞GR敲除导致L5神经元上PV突触（SYT2+）密度降低、胆囊收缩素（cholecystokinin, CCK）突触（CB1R+）密度增加，但对兴奋性突触无影响。snRNA-seq显示星形胶质细胞GR敲除主要改变兴奋性神经元基因表达，包括上调轴突萌发基因Epha3、Gap43和Robo1，这些基因与DR后野生型皮层兴奋性神经元中上调的基因相似。

"Astrocyte GR restricts neuronal plasticity"：成年期（P30-P40）星形胶质细胞GR敲除使动物在3-4天单眼剥夺后重新表现出ODP，表现为对开放眼反应增加、对剥夺眼反应减弱，而正常饲养条件下视觉反应不受影响。这表明消除星形胶质细胞GR信号足以在成熟视觉回路中重新激活关键期可塑性。

研究结论：眼睁开时，光照通过增加系统性CORT，驱动GR在星形胶质细胞中结合染色质，激活广泛的基因调控程序以促进星形胶质细胞成熟。该过程通过调控ECM成熟（特别是PNN形成）和抑制性突触平衡，限制神经元可塑性并促进关键期关闭。星形胶质细胞GR信号在跨脑区保守，且其特征在人类大脑发育中同样存在，提示该机制可能广泛适用于哺乳动物大脑发育。早期生活压力通过升高糖皮质激素可能干扰这一正常发育程序，增加神经精神疾病风险，而靶向调控该途径可能具有治疗潜力。