钙依赖性磷脂酶A2缺失导致小鼠去神经骨骼肌多组学改变

《Physiological Reports》：Loss of calcium-dependent phospholipase A2 contributes to multi-omic changes in mouse denervated skeletal muscle

　　

骨骼肌的年龄相关性神经支配丢失是肌少症的核心驱动因素。研究人员假设钙依赖性磷脂酶A2(cPLA2)缺失可通过改变氢过氧化物与氧化脂质生成，进而调控去神经肌肉转录组与脂质组以减轻萎缩。研究采用野生型与cPLA2全身敲除(cPLA2KO)小鼠的坐骨神经切断模型验证该假说。结果显示，与野生型对照相比，cPLA2基因缺失小鼠的腓肠肌中4,10,11,13,14-HDoHE、12-HEPE、9,10-EpOME及12,13-EpOME等多种氧化脂质含量显著升高。代谢物分析发现，去神经后果糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸及磷酸烯醇丙酮酸等糖酵解中间产物减少；α-羟基戊二酸和葡萄糖-6-磷酸在cPLA2KO小鼠肌肉中均呈低水平。转录组学分析显示，野生型与cPLA2KO小鼠的G蛋白偶联受体信号通路存在差异表达。与既往cPLA2抑制的保护效应相反，尽管cPLA2遗传缺失降低了腓肠肌氢过氧化物生成，却未能减轻去神经诱导的肌肉萎缩。

该研究由Oklahoma Medical Research Foundation团队完成，发表于《Physiological Reports》。肌少症是老龄化过程中骨骼肌质量与功能进行性下降的病理状态，显著增加跌倒、慢性病及死亡风险。已有证据表明，神经肌肉接头退变与去神经是肌少症发生的早期事件，且去神经肌肉中线粒体氢过氧化物生成显著升高，其脂质过氧化产物氧化脂质可作为毒性信号分子加剧肌肉损伤。钙依赖性磷脂酶A₂(cPLA₂)负责从膜磷脂释放多不饱和脂肪酸底物，经脂氧合酶等途径生成氧化脂质。既往药理学抑制cPLA₂可减轻去神经萎缩，且cPLA₂全身敲除小鼠在脑损伤模型中表现出神经保护效应，但在骨骼肌中的作用尚未明确。本研究旨在验证cPLA₂遗传缺失能否通过调控氧化脂质谱与多组学变化缓解去神经肌肉萎缩。

关键技术方法包括：采用6月龄C57BL/6J背景野生型与cPLA₂全身敲除小鼠，建立右侧坐骨神经切断去神经模型，左侧为假手术对照；通过定量磁共振测定体成分；分离腓肠肌进行靶向代谢组学、脂质组学（液相色谱-串联质谱法LC-MS/MS检测氧化磷脂、多不饱和脂肪酸PUFA及氧化脂质）、线粒体呼吸与氢过氧化物生成检测（ permeabilized fiber bundles结合Amplex UltraRed探针）、bulk RNA测序及G蛋白偶联受体信号通路qPCR阵列分析，所有数据采用双因素方差分析统计。

研究结果如下：

3.1 cPLA₂KO小鼠基础特征：两组年龄与体重无差异，但cPLA₂KO小鼠瘦体重百分比升高约20%，脂肪量百分比降低约50%；股四头肌与肝脏相对质量低于野生型，腓肠肌等器官质量无差异；免疫荧光证实cPLA₂定位于野生型肌膜，KO小鼠中无表达。

3.2 相关蛋白表达：野生型中去神经使cPLA₂蛋白升高2倍，KO小鼠中未检出；iPLA₂在去神经后升高约50%，基因型间无差异；12/15-脂氧合酶(12/15-LOX)在去神经后升高2倍，但在cPLA₂KO中较野生型降低约80%；谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)在野生型去神经肌肉中升高，KO小鼠中无此变化。

3.3 肌肉萎缩表型：去神经导致两组均出现肌萎缩，但cPLA₂KO小鼠的相对肌萎缩程度较野生型加重约15%。

3.4 糖酵解代谢改变：去神经使葡萄糖-6-磷酸降低约75%，果糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、3-磷酸甘油酸、磷酸烯醇丙酮酸均显著降低；cPLA₂KO小鼠的葡萄糖-6-磷酸水平进一步低于野生型。

3.5 三羧酸循环与氢过氧化物：苹果酸、延胡索酸等经典三羧酸循环中间产物无差异，但DL-α-羟基戊二酸在cPLA₂KO中降低约70%；线粒体呼吸功能无组间差异，去神经使氢过氧化物生成升高约10倍，而cPLA₂KO的去神经肌肉氢过氧化物水平低于野生型。

3.6 脂肪酸与氧化磷脂：cPLA₂KO小鼠含花生四烯酸的氧化磷脂水平升高10%–20%，提示膜脂肪酸释放受阻；亚油酸在野生型去神经中升高30%，二十二碳六烯酸(DHA)在cPLA₂KO去神经中降低20%，ω-6/ω-3比值在cPLA₂KO去神经中升高35%。

3.7 氧化脂质谱：ω-3来源的10-HDoHE、14-HDoHE、12-HEPE等在cPLA₂KO去神经肌肉中显著高于野生型去神经；ω-6来源的9,10-EpOME、12,13-EpOME同样在KO去神经组中升高。

3.8 转录组变化：去神经主导转录组改变，cPLA₂缺失影响较小；差异通路富集于RNA加工、钙响应、G蛋白偶联受体信号等；G蛋白偶联受体阵列显示，cPLA₂缺失使去神经诱导的差异基因数从野生型的25个降至10个，其中结缔组织生长因子(Ctgf)上调，白细胞介素1受体2(Il1r2)、B细胞淋巴瘤2(Bcl2)、血管紧张素Ⅱ受体1b(Agtr1b)下调。

讨论与结论：研究推翻了“cPLA₂遗传缺失可缓解去神经萎缩”的假说，药理学抑制与基因敲除的效应差异可能源于抑制剂的瞬时作用及对其他磷脂酶亚型的影响，或cPLA₂缺失同时消除了促炎与促修复脂质介质。尽管cPLA₂KO降低了氢过氧化物与12/15-LOX蛋白水平，但氧化脂质谱未相应降低，可能与iPLA₂代偿及其他代谢通路重塑有关。α-羟基戊二酸降低可能影响缺氧诱导因子HIF-1α稳定性，Agtr1b等萎缩相关基因的下调未能逆转表型，提示多通路交互调控的复杂性。该研究首次揭示cPLA₂在去神经骨骼肌中的多组学调控网络，为肌少症的脂质介导机制提供了新视角，提示靶向单一脂质代谢酶可能不足以阻断萎缩进程，需综合考量系统性代偿效应。