《Next Nanotechnology》：Smart drug delivery systems for potential targeted cancer therapy: Exploiting increased glutathione levels in tumor microenvironments
编辑推荐：
纳米颗粒药物载体系统在过去几十年中逐渐成为医学领域有前景的工具。当前药物治疗面临的一个持续性挑战是活性药物成分（APIs）的选择性有限，导致不良副作用。智能药物递送系统（Smart drug delivery systems, DDS）能够在特定刺激响应下释放
纳米颗粒药物载体系统在过去几十年中逐渐成为医学领域有前景的工具。当前药物治疗面临的一个持续性挑战是活性药物成分（APIs）的选择性有限，导致不良副作用。智能药物递送系统（Smart drug delivery systems, DDS）能够在特定刺激响应下释放封装活性药物成分，通过实现可控药物释放来提供潜在解决方案。该方法对于利用细胞外与细胞内环境之间的生化差异尤为重要。
本研究中，研究人员以非毒性化合物二硫苏糖醇（Dithiothreitol, DTT）制备了自降解聚二硫化物（Self-immolative polydisulfides, pDTT），并将其加工为纳米粒制剂，使其优先响应升高的谷胱甘肽（Glutathione, GSH）水平——该特征为细胞内环境的典型标志，且在肿瘤细胞中常升高。研究人员考察了聚合物链长对所制备纳米粒理化性质的影响。以Lumogen? Red（LR）作为模型物质包封，以测定载体系统的载药量。
通过动态光散射（Dynamic light scattering, DLS）和非对称流场流分离（Asymmetric flow field-flow fractionation, AF4）以及原子力显微镜（Atomic force microscopy, AFM）等成像技术对降解特性进行了表征。在高浓度谷胱甘肽条件下展示了包封物质的选择性释放，而在细胞外相关水平（10 μM谷胱甘肽）下未观察到显著释放，其行为与缓冲液对照相当。在细胞内相关条件下（2 – 10 mM谷胱甘肽）观察到释放增加。这些发现支持在类细胞内条件下的氧化还原响应性行为。后者通过原代成纤维细胞（Primary fibroblasts, pFb）以及癌细胞系BT-474、MCF-7和SK-BR-3中细胞内低分子量巯基的定量分析得到验证。通过共聚焦激光扫描显微镜（Confocal laser scanning microscopy, CLSM）观察，证实了纳米粒在所研究的细胞系中的摄取。通过溶酶体染色显示纳米粒在溶酶体中积累。此外，载体系统本身在针对不同细胞类型的细胞培养研究中未显示出细胞毒性。所开发的系统是可控药物释放背景下一种合适且极具前景的智能药物递送系统。
智能药物递送系统作为克服传统化疗药物选择性不足、降低毒副作用的重要策略，近年受到广泛关注。肿瘤组织与正常组织相比具有独特的微环境特征，包括轻度酸性的细胞外pH、特定受体的过表达以及显著的还原性环境。其中，谷胱甘肽（GSH）在调控肿瘤组织氧化还原状态中发挥核心作用，其升高水平与癌细胞增殖和转移密切相关，同时增强了癌细胞对氧化应激的抵抗能力和对化疗药物的耐药性。利用肿瘤细胞内外谷胱甘肽浓度的显著差异（细胞外约2–10 μM，细胞内约2–10 mM）设计刺激响应型纳米载体，成为实现靶向可控释放的有效途径。
自降解聚二硫化物（pDTT）基于非毒性化合物二硫苏糖醇（DTT）开发，其二硫键可在还原性环境中断裂，引发聚合物自降解行为。V?llmecke等前期工作主要聚焦于pDTT的聚合化学、结构表征及还原降解机制，虽初步展示了纳米粒制备的可行性，但尚未系统研究其作为药物递送系统的性能。本研究在此基础上，将研究重心转向pDTT纳米粒的制剂优化与评价，扩展了纳米粒制备研究，分析了聚合物链长及批间差异对纳米粒形成参数的影响，并采用荧光染料模型负载评价其可控释放能力，同时通过多种细胞系深入研究了纳米粒的细胞内行为。
研究人员采用溶剂置换法制备了不同链长pDTT聚合物（pDTT21、pDTT37/38、pDTT69）的纳米粒，系统考察了批间变异性和聚合物链长对纳米粒理化性质的影响。中链聚合物pDTT37在不同批次合成中表现出良好的重现性，所得纳米粒粒径约190 nm，多分散指数（PDI）约0.1，批间无显著差异。放大规模制备的pDTT35纳米粒平均粒径相当，但PDI略有升高至0.16。不同链长聚合物制备的纳米粒粒径在179–185 nm范围内，PDI接近单分散，未观察到链长对纳米粒性质的显著影响。所有制剂均处于适合逃逸肝脏和脾脏清除、同时受益于增强渗透与滞留（EPR）效应的100–200 nm最佳粒径范围内。
纳米粒的稳定性测试表明，在生理离子强度（约150 mmol/L NaCl）及生理pH条件下，系统保持稳定，水动力直径和PDI无显著变化。在肿瘤组织特征性轻度酸性环境（pH 6.7）下亦保持稳定。但在pH低于5时，所有纳米粒均出现粒径增大，可能与zeta电位逐渐中性化、静电排斥减弱导致的聚集有关。
刺激响应性降解是评价该系统智能释药功能的核心。通过DLS监测count rate变化，10 mM GSH（细胞内水平）处理2小时内count rate降至初始值的40%，24小时后低于10%；2 mM GSH呈现相似趋势。相反，10 μM GSH（细胞外水平）处理与缓冲液对照相似，24小时后仍维持60–70%的初始信号强度，表明无明显响应性降解。AFM可视化证实了降解后纳米粒形貌的显著变化：未处理样品仅20%颗粒高度低于20 nm，而GSH处理后所有测量值均低于此阈值。AF4多检测器联用分析进一步验证了降解过程中MALS和UV信号的降低，以及FLD信号的初始升高现象，提示聚合物基质侵蚀可能减少了染料屏蔽效应。
释放研究采用HPLC-FLD定量分析，结果显示1%、2%和10%三种不同载药量的pDTT37纳米粒在10 μM GSH条件下释放量均可忽略（<2%），与缓冲液对照无差异；而在2 mM和10 mM GSH条件下呈现显著的选择性释放。值得注意的是，10%载药量制剂的最大释放率约30%，明显低于2%和1%制剂的约80%，此现象归因于LR在水中极低的溶解度（<0.002 μg/mL）限制了释放，而非降解效率不足。释放的LR浓度可达4.5±0.7 μg/mL，远超其结晶溶解度，提示药物以无定形或分子分散状态存在于聚合物基质中。
细胞毒性评价涵盖BT-474、MCF-7、SK-BR-3三种乳腺癌细胞系及原代成纤维细胞（pFb）。WST-1、LDH释放和caspase-3活性三种检测方法一致表明，完整pDTT纳米粒及其GSH诱导降解产物在高达500 μg/mL浓度下对四种细胞均无毒性，且聚合物链长对细胞毒性无影响。
细胞内低分子量巯基定量分析显示，MCF-7细胞当量GSH浓度（eGSH）最低（2.5 mM），BT-474和SK-BR-3分别为6.7 mM和6.4 mM，pFb最高（12.7 mM），所有细胞均含有足以触发纳米粒降解的巯基水平。CLSM直观证实了pDTT38纳米粒在四种细胞中的时间依赖性摄取，24小时后胞浆呈现均匀红色荧光，且平均荧光强度显著高于非响应性PLGA纳米粒对照，提示可能涉及巯基介导的摄取机制。MCF-7 nuc-pFb共培养系统中，pFb表现出优于MCF-7细胞的纳米粒摄取。溶酶体追踪实验表明纳米粒在溶酶体中积累，为后续设计溶酶体逃逸策略以提高疗效提供了重要参考。
综上所述，本研究成功开发了一种基于自降解聚二硫化物的智能药物递送系统。该系统在不同聚合物链长下均表现出可比的理化性质、稳定性和生物相容性。关键成就在于实现了细胞内谷甘肽浓度依赖性的选择性药物释放，有效抑制了细胞外环境下的早熟释放。纳米粒展现出优异的细胞摄取能力和明确的溶酶体定位特征，且无任何细胞毒性，为其作为靶向抗癌药物载体奠定了坚实基础。然而，研究者也指出该系统尚处于体外评价阶段，蛋白质冠形成及血清组分对纳米粒行为的影响、活性药物成分的装载与释放动力学等关键问题，有待在后续研究中深入探索。该论文发表于《Next Nanotechnology》。
研究采用的关键技术方法包括：以非毒性二硫苏糖醇为原料合成不同链长自降解聚二硫化物，通过溶剂置换法制备纳米粒并冷冻干燥；采用动态光散射测定纳米粒水动力直径、多分散指数和zeta电位，结合扫描电子显微镜和原子力显微镜进行形貌表征；利用非对称流场流分离联用多角光散射、紫外-可见和荧光检测器分析降解行为；高效液相色谱-荧光检测法定量模型物质Lumogen? Red的包封与释放；在原代成纤维细胞、BT-474、MCF-7和SK-BR-3细胞系中进行WST-1、LDH释放和caspase-3活性测定评价细胞毒性；以单氯二胺反应结合酶标仪荧光检测法定量细胞内低分子量巯基；应用共聚焦激光扫描显微镜和荧光显微镜观察纳米粒细胞摄取、胞内分布及溶酶体共定位。
研究结果部分按以下结构展开：
聚合物链长及批间差异对纳米粒理化性质的影响：批间可重现性良好，放大规模制备导致PDI轻微升高；不同链长纳米粒粒径和PDI无显著差异，均满足药物载体应用标准。
模型物质包封与载药量相关性：LR包封纳米粒理化性质与未载药系统基本相当；载药量与投入LR量呈正相关，证实不同浓度染料负载的可行性。
纳米粒对电解质和pH变化的稳定性：生理离子强度及pH条件下稳定；酸性环境（pH<5）下粒径增大，与zeta电位降低相关。
谷甘肽触发的选择性降解动态光散射分析：仅在≥2 mM GSH细胞内浓度下发生显著降解，10 μM GSH条件下与对照无差异；链长对降解速率无显著影响；LR包封不影响降解趋势。
成像技术可视化谷甘肽触发变化：原子力显微镜证实GSH处理后纳米粒高度显著降低，支持降解结论。
非对称流场流分离考察降解：MALS和UV信号随时间降低，FLD信号初始升高后下降，提示侵蚀控释机制和LR释放；缓冲液对照无变化，证实降解的选择性。
释放研究：低GSH条件下释放可忽略，高GSH条件下显著释放；载药量影响最大释放率，受LR溶解度限制；与文献报道系统相比具有更低的背景释放和更高的选择性。
未包衣纳米粒细胞毒性：完整纳米粒及降解产物对四种细胞均无毒性，链长无影响。
细胞摄取与胞内降解：所有测试细胞均含足够巯基触发降解；纳米粒呈时间依赖性摄取，荧光强度高于PLGA对照；溶酶体定位明确；共培养系统中pFb摄取优于MCF-7细胞。
讨论部分总结：本研究开发的pDTT纳米粒系统成功实现了基于细胞内GSH浓度梯度的智能响应性释药。聚合物链长不是决定性因素，为简化生产提供了灵活性。系统的突出优势在于极低的细胞外释放背景和高选择性的细胞内响应，这归因于自降解聚合物架构促进的基质侵蚀机制。与pH响应系统相比，GSH的浓度梯度更为显著，提供了更锐利的生化触发。然而，蛋白质冠的影响、血清条件下的行为、以及活性药物成分与模型物质在释放动力学上的潜在差异，是未来转化应用前必须解决的关键问题。溶酶体积累现象提示需要进一步优化以实现溶酶体逃逸，但对于某些作用靶点在溶酶体的药物而言，该特性也可能是有利的。
研究结论：本研究成功开发了基于pDTT的智能药物递送系统。使用不同聚合物链长制备了理化性质可比的pDTT纳米粒。全面表征表明，聚合物链长对纳米粒的稳定性、氧化还原响应行为或生物相容性无显著影响。采用荧光染料作为模型物质的负载在各系统间产生可比较的结果。降解研究中观察到的趋势在释放行为中得到反映。总体而言，成功开发了一种在细胞内样GSH浓度（体外）触发下显示选择性释放的智能药物递送系统。此外，所研究的纳米粒及其降解产物在不同细胞类型中均未显示细胞毒性。所有细胞中的细胞内巯基含量均足以引起药物递送系统的细胞内降解。然而，纳米粒在溶酶体中积累。由于pDTT纳米粒表现出优异的细胞摄取，如与PLGA纳米粒相比更强的荧光强度所示，它们似乎是实现有效和选择性细胞内药物释放的有前景工具。然而，所有数据均仅在体外获得，不应直接外推至复杂的体内系统。蛋白质冠的形成和血清组分的存在是影响纳米粒稳定性、降解动力学和释放行为的重要而复杂的方面。因此，未来研究将系统调查蛋白质冠形成及其后果。另一局限性在于未包封活性药物成分。模型物质与活性药物成分之间可能存在释放动力学方面的定量差异。因此，未来工作需要专门的活性药物成分装载和释放研究，以全面评估治疗性能。
