《PROTEOMICS》：Proteomic Profiling Using a Proximity Extension Assay Panel on Serum Samples Stored at ?25°C Over Several Decades
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近年来，能够在较小样本体积中同时获得数千种蛋白质准确定量的蛋白质组学检测技术的发展，为珍贵生物样本库的生物标志物研究提供了新机遇。研究人员利用Olink邻近延伸检测（proximity extension assay, PEA）技术，对Janus血清银行（Ja
近年来，能够在较小样本体积中同时获得数千种蛋白质准确定量的蛋白质组学检测技术的发展，为珍贵生物样本库的生物标志物研究提供了新机遇。研究人员利用Olink邻近延伸检测（proximity extension assay, PEA）技术，对Janus血清银行（Janus Serum Bank, JSB）中于?25°C储存数十年的血清样本进行了蛋白质组学分析。研究针对体重指数、性别、吸烟状态及储存时间进行了关联分析，并将结果与英国生物样本库（UK Biobank, UKB）中相同性状的蛋白质关联数据进行对比。结果显示，分析表型对应的蛋白质水平存在显著且合理的关联，且这些关联与UKB大规模研究中获得的关联具有高度相关性。UKB样本采集符合现代标准，血液样本处理时间短、储存温度极低；而JSB样本采集时间跨度大，储存温度低于现行最优标准且储存时间极长。本研究表明，即使在次优条件下储存极长时间（最长达50年）的样本，使用PEA技术仍能获得常见性状的可靠蛋白质关联结果。因此，包括JSB在内的非最优条件储存的档案生物样本，在使用现代及新兴蛋白质组学检测方法时，仍是疾病与风险生物标志物研究的宝贵资源。
本研究发表于《PROTEOMICS》，聚焦于长期非最优低温储存条件下人类血清样本的蛋白质组学可用性验证。研究背景方面，当前大规模定量蛋白质检测技术结合DNA测序与蛋白质识别，已能经济高效地解析蛋白质与疾病及其他性状的关联，其中PEA技术与适配体检测技术在UKB样本中的一致性已被证实。现代生物样本库如UKB普遍采用?80°C或更低温度储存以维持生物分子完整性，但大量历史样本库因早期技术限制仅能在?25°C长期储存，其蛋白质稳定性与科研适用性尚未得到系统性验证。Janus血清银行（JSB）作为挪威大型前瞻性队列，自1972年至2004年共收集318628名捐赠者的超过70万份血清样本，并与挪威癌症登记系统关联，截至2023年已记录近12.4万例癌症发病，但因储存温度高于现行标准，其用于大规模蛋白质组学研究的可行性存疑。本研究旨在验证JSB样本经PEA技术检测后能否产生高质量蛋白质组谱，并与储存条件更优、储存时间更短的UKB数据进行跨平台比对。
研究人员从JSB中筛选348名无癌症诊断且随访超过10年的逝者样本，按性别、吸烟状态、体重指数三分位均衡匹配，覆盖1972至2004年三个采集时段。样本经解冻、分装后送至冰岛deCODE genetics实验室，随机分配至四个96孔检测板，每板设置8个内部质控位点。使用Olink Explore PEA panel检测2939个靶点（对应2923种独特蛋白质），对重复样本取标准化蛋白质表达值（Normalized Protein Expression, NPX）均值合并。质量控制采用主成分分析（principal component analysis, PCA）剔除偏离均值5个标准差以上的异常样本。统计分析基于线性模型，将蛋白质NPX值作为结局变量，输入变量包括采血年龄、体重指数、采集分组、性别、吸烟状态及储存年数，效应量以β系数（连续变量）或比值比（分类变量）表示，显著性校正采用Benjamini-Hochberg法控制错误发现率（false discovery rate, fdr）<0.05。跨组关联相关性采用Spearman相关系数评估，所有分析基于R 4.3.2完成。
研究结果分为四部分。第一，样本特征显示最终纳入分析的347份样本平均储存时间为40年（范围32–51年），性别、年龄、体重指数及吸烟状态在各采集组中分布均衡。第二，采集组比较发现，1972–1978年采集的Group 1因使用含碘乙酸盐抗凝管，在PCA中与Group 2（1979–1986年，无添加剂玻璃管）及Group 3（1987–2004年，凝胶促凝管）明显分离，差异最显著的五个蛋白质靶点依次为GNPDA2、QDPR、SHMT1、TPK1及APOA2，推测与碘乙酸盐对酶活性的不可逆修饰干扰抗原识别有关。第三，表型关联分析显示，储存时间与1540个靶点显著相关（占总数52%），性别关联靶点949个（32%），吸烟状态672个（23%），体重指数602个（20%）。最强关联靶点均符合已知生物学机制：体重指数最高关联为瘦素（LEP），性别最高关联为胰岛素样肽3（INSL3，睾丸支持细胞分泌），吸烟最高关联为碱性磷酸酶胎盘型（ALPP，吸烟者显著升高）。第四，分层分析表明，除储存时间外，各采集组内体重指数、性别、吸烟状态的效应量与总队列高度一致（Spearman ρ=0.81–0.92），而储存时间关联在不同组中方向不一。第五，与UKB数据比对显示，JSB中体重指数、性别、吸烟状态及储存时间的蛋白质关联效应量与UKB呈显著正相关（ρ=0.61–0.75），证明次优储存条件未破坏核心生物学关联信号。
讨论部分指出，尽管Group 1因碘乙酸盐处理存在特定酶蛋白检测偏差，但主要表型的蛋白质关联仍稳健，且低丰度与高丰度蛋白质的储存稳定性无显著差异。JSB与UKB的储存温度差（?25°C vs ?80°C）与时间差（32–51年 vs 11–16年）可能是储存时间关联异质性的原因。研究结论明确，在?25°C储存长达50年的血清样本经PEA技术检测可获得可靠的表型关联结果，历史生物样本库在癌症等疾病的生物标志物研究中具有重要应用潜力。
