《Oil Crop Science》：An attempt to synthesize Nervonic acid in rapeseed leaves by metabolic engineering
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由于神经酸（Nervonic acid，NA）作为一种超长链单不饱和脂肪酸（Very Long-Chain Monounsaturated Fatty Acid，VLCMFA，碳链长度22–26）在脑部疾病预防与改善方面具有极高价值，已有大量研究通过遗传工程手
由于神经酸（Nervonic acid，NA）作为一种超长链单不饱和脂肪酸（Very Long-Chain Monounsaturated Fatty Acid，VLCMFA，碳链长度22–26）在脑部疾病预防与改善方面具有极高价值，已有大量研究通过遗传工程手段在作物种子中实现其合成。近年来，叶片等营养组织被提出作为生产三酰甘油（Triacylglycerol，TAG）的新型平台并取得显著进展，但其在神经酸合成方面的潜力尚未得到探索。本研究选取三个功能基因——来自希腊碎米荠的CgKCS、酿酒酵母的SLC1-1以及拟南芥的DGAT1，在绿色组织特异性启动子Rubisco驱动下构建多基因载体，转化四种脂肪酸组成各异的油菜品种，以探究叶片中神经酸合成的可行性。上述基因此前分别被报道可提高神经酸产量、促进脂肪酸结合至TAG的sn-2位以及提升作物种子含油量。结果显示，在营养生长、开花及结荚三个发育阶段的所有转基因油菜叶片中均未检测到神经酸。脂肪酸组分分析表明，叶片中主要脂肪酸为亚麻酸（C18:3），而神经酸合成可利用的底物为油酸（C18:1）、芥酸（C20:1）和山嵛酸（C22:1）等单不饱和脂肪酸，因此单不饱和脂肪酸缺乏可能是转基因油菜叶片无法合成神经酸的主要限制因素。在此基础上，研究人员进一步分析了促进神经酸及其他超长链脂肪酸合成、组装与积累的可行策略。综上，本研究明确了油菜叶片的脂肪酸组成特征，尽管未能实现神经酸合成，仍为通过代谢工程手段利用油菜叶片生产神经酸提供了可借鉴的研究线索。
该研究发表于《Oil Crop Science》，聚焦于利用代谢工程手段拓展神经酸（NA）生物合成的组织来源。神经酸作为髓鞘关键组分，在脑发育、神经损伤修复及阿尔茨海默病干预中具有重要价值，目前商业化依赖非主栽作物种子，存在生长周期长、产量不稳定等问题，而叶片作为新型油脂合成平台尚未在神经酸生产中验证。研究人员尝试将油菜叶片转化为“绿色工厂”，旨在通过基因工程实现高含量神经酸积累，为功能性蔬菜或饲料开发提供新路径。
研究采用的核心技术方法包括：选用4种不同脂肪酸背景的半冬性油菜品种（ZY821、GJ1、HZJ、ZS6）作为遗传转化受体；构建由叶片特异性Rubisco启动子驱动的CgKCS、SLC1-1、DGAT1多基因表达载体；通过农杆菌介导的下胚轴转化法获得转基因植株；利用Bar基因检测与实时荧光定量PCR验证转基因阳性及外源基因表达；采用气相色谱（GC）分析不同发育阶段叶片与种子的脂肪酸组成及含量。
研究结果如下：
多基因载体构建与转基因植株获得：成功构建Rubisco-3多基因载体，转化4种油菜品种后共获得61株独立转化体，转基因植株与野生型在农艺性状上无显著差异。
转基因表达验证：实时荧光定量PCR结果显示，CgKCS与DGAT1在所有转基因株系中均表达，其中ZY821背景株系表达量较高；DGAT1表达水平普遍高于CgKCS；SLC1-1仅在ZY821与GJ1背景株系中低水平表达。
神经酸及脂肪酸积累特征：气相色谱分析显示，所有转基因株系叶片在营养期、花期、结荚期均未检测到神经酸；叶片脂肪酸以亚麻酸（C18:3）为主（占比近50%），仅含微量单不饱和脂肪酸底物；不同背景株系在转基因后脂肪酸组成发生差异变化，但未出现神经酸积累。
种子脂肪酸组成分析：转基因未显著影响高芥酸品种的芥酸（C22:1）含量；ZY821与GJ1转基因种子中C18:1、C18:2、C18:3及C20:1变化趋势相反，提示载体可能间接调控不同品种的单不饱和脂肪酸代谢流向。
叶片含油量测定：转基因株系叶片含油量与野生型相比无显著变化，含油量随发育进程逐渐升高，结荚期达到峰值。
讨论部分指出，神经酸合成失败的主要原因是叶片中缺乏KCS酶可用的单不饱和脂肪酸底物（C18:1、C20:1、C22:1）。研究人员基于“Push-Pull-Package”策略提出改进方向：“Push”层面可通过敲除脂肪酸去饱和酶2（FAD2）阻断C18:1向多不饱和脂肪酸转化，提高可用底物水平；“Pull”层面需筛选能特异性将神经酸组装至TAG sn-2位的溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAAT），并联合转录因子WRINKLED1（WRI1）、LEAFY COTYLEDON1（LEC1）等提升脂肪酸合成通量；“Package”层面可引入油体蛋白（Oleosin）增强TAG储存稳定性；同时需优化多基因载体的启动子多样性与基因排列顺序，避免同源重组导致的表达沉默。该研究虽未实现叶片神经酸合成，但明确了油菜叶片脂肪酸代谢特征，为后续代谢工程改造提供了关键限制因子与优化路径。
