《Pharmacological Research》：Plumbagin Ameliorates Multiple Sclerosis by Inducing DDX3X-Mediated Stress Granule Assembly in Mice
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多发性硬化（multiple sclerosis, MS）是一种累及中枢神经系统（central nervous system, CNS）的慢性炎症性脱髓鞘疾病，现有治疗手段有限。应激性颗粒（stress granules, SGs）是细胞应对应激时通过液-液
多发性硬化（multiple sclerosis, MS）是一种累及中枢神经系统（central nervous system, CNS）的慢性炎症性脱髓鞘疾病，现有治疗手段有限。应激性颗粒（stress granules, SGs）是细胞应对应激时通过液-液相分离（liquid-liquid phase separation, LLPS）形成的无膜细胞器，作为细胞保护机制可抵抗应激诱导的细胞凋亡和细胞焦亡（pyroptosis）。SGs可通过扣押DEAD盒解旋酶3 X-连锁（dead-box helicase 3 X-linked, DDX3X）来拮抗NLRP3炎症小体，从而促进焦亡细胞的存活。本研究中，研究人员鉴定出白花丹醌（plumbagin, PL）——一种具有抗氧化和抗炎活性的天然萘醌类化合物——为一种新型SG诱导剂。在小胶质细胞中，PL诱导的SGs以DDX3X为潜在靶点，抑制了NLRP3介导的细胞焦亡及随后的线粒体功能障碍。此外，PL在双环己酮草酰二腙（cuprizone, CPZ）和实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）两种小鼠模型中均减轻了CNS的神经炎症、脱髓鞘和氧化应激。研究结果表明，PL可通过调控DDX3X-SG轴缓解神经炎症和髓鞘损伤，为MS的治疗提供了新策略。
多发性硬化（multiple sclerosis, MS）是一种以中枢神经系统（central nervous system, CNS）慢性炎症和脱髓鞘为特征的 progressive 性疾病，主要累及脑和脊髓神经纤维的髓鞘。现有治疗手段如细胞因子、免疫调节剂和单克隆抗体虽可调节免疫系统并降低复发率，但对 progressive MS 的疗效有限，凸显了新策略研发的迫切需求。NLRP3炎症小体在小胶质细胞中的激活被认为是MS发病的关键驱动因素，其激活可促进白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）和白细胞介素-18（interleukin-18, IL-18）的成熟与分泌，进而加剧神经炎症。NLRP3抑制剂在MS的临床前及临床研究中已显示出治疗潜力。
应激性颗粒（stress granules, SGs）是细胞应激响应中形成的动态无膜细胞器，主要由RNA和RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs）通过液-液相分离（liquid-liquid phase separation, LLPS）组装而成。持续性或失调的SGs通过促进淀粉样蛋白聚集和传播加剧神经退行性疾病，而动态可逆的SGs则发挥保护功能。SGs作为区室化结构可通过招募多种关键组分调控炎症反应。DEAD盒解旋酶3 X-连锁（dead-box helicase 3 X-linked, DDX3X）是SG动态调控的核心组分，同时也参与激活NLRP3炎症小体；在应激条件下，SG形成可扣押DDX3X，从而抑制NLRP3炎症小体组装，发挥"存活-死亡检查点"功能，抑制细胞焦亡。Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）参与神经炎症的起始，通过上调DDX3X表达加剧NLRP3介导的小胶质细胞焦亡。线粒体功能障碍被认为是MS中轴突和神经元损伤的关键因素，激活的小胶质细胞释放大量活性氧（reactive oxygen species, ROS）和一氧化氮（nitric oxide, NO），诱导髓鞘化和脱髓鞘轴突的线粒体功能障碍。细胞焦亡的关键下游事件——孔形成蛋白Gasdermin D（GSDMD）激活后不仅插入质膜，还可插入线粒体膜，导致线粒体膜电位丧失、ROS积累增加及氧化损伤与炎性细胞死亡的自我延续循环。值得注意的是，SGs定位于细胞质并与线粒体、内质网和溶酶体等特定细胞器相互作用，可能通过调控细胞器膜通透性、信号转导和损伤修复来对抗焦亡驱动的线粒体损伤。
白花丹醌（plumbagin, PL）是一种天然萘醌类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤和抗炎活性，且具有良好的血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）通透性。研究表明PL可抑制小胶质细胞激活及NO、IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）等促炎介质的释放，其多靶点作用机制包括增强核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）抗氧化通路、抑制核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）信号以及选择性抑制瞬时受体电位香草素2（transient receptor potential vanilloid 2, TRPV2）通道等。
基于HeLa-G3BP2/GFP报告基因系统的筛选，研究人员确定PL为一种新型SG诱导剂。研究旨在阐明PL诱导的SGs是否具有独特的动态特征，以及其通过SG-DDX3X轴抑制NLRP3炎症小体介导的小胶质细胞焦亡和氧化应激的分子机制，并进一步在CPZ和EAE两种MS动物模型中验证PL的神经保护效应。
本研究发表于《Pharmacological Research》。研究所采用的主要关键技术方法包括：基于HeLa-G3BP2/GFP报告基因系统的SG诱导剂筛选；分子对接技术分析PL与DDX3X蛋白的结合模式；药物亲和反应的靶点稳定性（drug affinity responsive target stability, DARTS）实验验证PL与DDX3X的直接结合；孔雀石绿磷酸盐检测法测定DDX3X的ATP酶活性；蛋白表达和纯化后进行体外液-液相分离实验；利用LPS和尼日利亚菌素诱导小胶质细胞焦亡模型；JC-1染色和MitoTracker Red CMXRos染色评估线粒体膜电位和形态；DCFH-DA探针结合流式细胞术检测ROS水平；建立CPZ诱导的脱髓鞘模型（雄性C57BL/6小鼠）和EAE模型（雌性C57BL/6小鼠），并进行旷场实验、Y迷宫实验、平衡木实验和爬杆实验等行为学评估；快蓝（Luxol Fast Blue, LFB）染色和髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein, MBP）免疫组织化学评估髓鞘完整性；酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测血清IL-1β、IL-18和4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal, 4-HNE）水平；硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid, TBA）法检测丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量；定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）检测Nox2和Nox4的mRNA表达。
研究结果部分，"PL可逆性地诱导体外SG形成"：利用HeLa-G3BP2/EGFP报告细胞筛选SG诱导剂，发现PL以剂量依赖方式触发SG形成，并通过免疫荧光证实其在HMC3细胞（人小胶质细胞系）中促进内源性G3BP1阳性SG组装。PL诱导的SGs包含G3BP1、G3BP2和TIA1等核心蛋白组分，且在3-25 μM浓度范围内对细胞增殖无显著影响，排除了细胞毒性作为主要驱动因素。PL处理促进eIF2α磷酸化，而整合应激反应抑制剂（integrated stress response inhibitor, ISRIB）可逆转PL诱导的SG组装，证实翻译抑制介导了PL诱导的SG形成。时间序列观察显示PL（6 μM）在1小时内诱导约40%细胞发生SG组装，该动态过程可持续至少8小时，24小时后完全解聚，证实PL触发动态可逆的SG响应。
"PL与DDX3X结合并抑制其RNA依赖性ATP酶活性"：分子对接分析显示PL对DDX3X具有强结合亲和力（-7.252 kcal/mol），通过疏水相互作用（3.8 ?和4.0 ?）、π-π堆积（3.8 ?）与TYR-200残基结合，并与GLN-207形成氢键（3.3 ?），提示PL可能结合于DDX3X的DEAD1结构域。DARTS实验证实PL与DDX3X的直接结合，免疫荧光显示PL诱导的SG与DDX3X共定位。PL显著抑制DDX3X的RNA依赖性ATP酶活性，且与已知DDX3X抑制剂RK-33类似，可延缓砷酸钠（sodium arsenite, SA）诱导的SG解聚。DDX3X敲除显著削弱PL诱导的SG组装，体外LLPS实验证实PL促进DDX3X与G3BP1-GFP的凝聚。重要的是，急性或慢性PL处理均未诱导异质性核糖核蛋白A1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1, hnRNPA1）的异常定位，提示PL诱导的SG组装不驱动病理性聚集体形成。在原代人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, HUMSCs）中，PL同样可诱导与DDX3X共定位的G3BP1阳性SGs。
"PL通过SGs-DDX3X轴抑制NLRP3炎症小体激活，保护小胶质细胞免于焦亡"：在过表达NLRP3的HMC3细胞中，SA或PL诱导的SG减少NLRP3聚集体数量，提示SG组装竞争性抑制NLRP3炎症小体激活。PL显著抑制LPS和尼日利亚菌素诱导的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放，下调NLRP3、N-GSDMD、切割型caspase-1（p20）及成熟IL-1β和IL-18的表达。G3BP1/G3BP2双敲除后，PL抑制细胞焦亡的效应被消除，包括LDH释放、焦亡标志物蛋白水平及IL-1β和IL-18分泌的抑制均消失，证实PL通过诱导SG形成发挥抗炎和抗焦亡作用。
"PL改善小胶质细胞焦亡诱导的氧化损伤"：PL处理逆转了焦亡诱导的细胞ATP耗竭，显著降低ROS水平，缓解线粒体膜电位丧失。G3BP1/G3BP2敲除阻断了PL对线粒体功能障碍和氧化损伤的保护作用。此外，LPS和尼日利亚菌素处理促进GSDMD在线粒体周围积累，而PL处理抑制了这一过程，支持PL通过SG组装抑制GSDMD介导的线粒体功能障碍和氧化损伤。
"PL在CPZ小鼠中发挥髓鞘保护和神经炎症抑制作用"：在CPZ诱导的脱髓鞘模型中，PL处理（2 mg/kg/d，灌胃）缓解体重下降，改善平衡木实验、爬杆实验、旷场实验和Y迷宫实验中的运动和认知功能。LFB染色和MBP免疫组织化学证实PL抑制胼胝体和海马CA3及DG区域的髓鞘丢失。PL处理增强胼胝体中G3BP1与DDX3X的共定位及eIF2α磷酸化水平。PL减少IBA1阳性面积，降低IBA1?/iNOS?双阳性细胞数量，抑制促炎型小胶质细胞激活。ELISA显示PL降低血清IL-1β和IL-18水平。PL还降低血清4-HNE、胼胝体MDA含量以及Nox2和Nox4的mRNA表达，表明其缓解氧化应激。
"PL在EAE小鼠中发挥髓鞘保护和神经炎症抑制作用"：在EAE模型中，PL处理（2 mg/kg/d，灌胃）减轻体重下降，降低临床评分，尤其在疾病早期减轻神经功能缺损，并在第18-26天加速恢复。LFB和HE染色显示PL改善脊髓脱髓鞘和炎性浸润。PL诱导腰髓中DDX3X阳性SG组装，增强eIF2α磷酸化。PL降低血清IL-1β、IL-18和4-HNE水平，减少脊髓MDA含量及Nox2和Nox4 mRNA表达。
讨论部分，研究人员系统论证了天然化合物PL作为强效SG诱导剂的分子机制及治疗潜力。PL通过靶向抑制DDX3X的RNA依赖性ATP酶活性，促进G3BP1凝聚体形成，进而通过DDX3X阳性SG组装抑制NLRP3炎症小体激活，缓解小胶质细胞的信号紊乱和氧化应激。在CPZ和EAE两种脱髓鞘与神经炎症模型中，PL成功诱导SG形成，显著改善运动和认知功能障碍，减轻髓鞘丢失、神经炎症和氧化应激。这些发现确立了SG诱导作为PL发挥多层次神经保护作用的主要机制。
研究人员指出，MS是一种病因不明、尚无治愈方法的progressive性CNS炎性脱髓鞘疾病。炎症小体相关caspase介导促炎细胞因子IL-1β和IL-18的成熟释放，并激活孔形成蛋白GSDMD，驱动MS中的小胶质细胞焦亡。临床前研究表明NLRP3抑制剂和caspase-1抑制剂可缓解MS动物模型的疾病进展，凸显了抑制NLRP3/caspase-1介导焦亡的治疗潜力。PL在体外炎性小胶质细胞焦亡模型和体内MS模型中均表现出保护效应，包括防止质膜破裂、减少炎性因子释放和缓解氧化应激，提示PL介导的焦亡抑制有助于体外和体内模型的神经保护。
SGs是动态无膜细胞器，其失调或持续存在可促成多种神经退行性疾病的发病。在脱髓鞘模型中，核蛋白异常定位于细胞质并与SG共定位可驱动病理性SG形成。然而，适当的SG组装也具有神经保护作用，单纯抑制SG组装无法逆转神经退行性变，提示靶向恢复SG动态平衡可能更具治疗意义。PL通过增强eIF2α磷酸化促进SG形成，在非细胞毒性浓度下诱导动态SG组装，长期处理不会在慢性氧化应激条件下导致病理性SG积累，支持PL可能作为神经退行性疾病中的SG补充剂，通过促进生理性可逆SG形成发挥神经保护功能。
研究人员观察到EAE和CPZ模型中SG组装模式的差异：CPZ小鼠胼胝体中检测到大量SG形成，而EAE小鼠脊髓中SG较少。对此的解释是，CPZ作为一种铜螯合剂，可在少突胶质细胞和小胶质细胞中诱导强烈的氧化应激和内质网应激——这些都是SG建立的明确触发因素；且CPZ模型中应激源持续存在，而EAE模型中早期免疫反应强烈，后期应激强度下降。这一假说得到了eIF2α磷酸化水平变化的支持。
DDX3X参与RNA代谢多个过程，在SG核心网络中占据中心枢纽位置。急性药理学抑制DDX3X可促进SG组装并延缓其解聚。PL与DDX3X的DEAD1结构域中TYR-200和GLN-207残基结合（与已知抑制剂RK-33的靶点相同），抑制其ATP酶活性，从而促进SG组装并延缓SA诱导的SG解聚。DDX3X促进焦亡而SGs扣押DDX3X以竞争性抑制该过程，这种机制已在心肌损伤、缺血再灌注损伤、肝损伤和病毒感染等多种病理背景下被认定为保护机制。本研究首次揭示PL作为DDX3X抑制剂，动态诱导SG组装，抑制小胶质细胞焦亡和氧化应激，并在神经炎症和脱髓鞘小鼠模型中发挥神经保护作用，凸显了靶向DDX3X-SG轴在治疗焦亡相关疾病中的潜力。
此外，线粒体膜电位降低、氧化损伤和细胞死亡在MS动物模型中均有观察到，表明氧化应激也参与MS发病。GSDMD不仅可在质膜形成孔道，也可在线粒体膜形成孔道，导致线粒体膜电位下降和ROS积累，加速焦亡。PL诱导的SG阳性细胞中线粒体形态更接近正常细胞，PL处理逆转了焦亡细胞的线粒体功能障碍，且GSDMD在线粒体周围积累减少。同时，PL降低两种模型中MDA和4-HNE等脂质过氧化标志物水平，下调Nox2和Nox4的mRNA表达，支持其广泛的抗氧化效应，与抵御GSDMD介导的线粒体损伤形成互补。
研究局限性包括未考虑性别因素对PL药效学或治疗效应的潜在影响：CPZ模型仅使用雄性小鼠，EAE模型仅使用雌性小鼠。此外，PL在CNS中的长期安全性和潜在脱靶效应有待未来系统评估。
研究结论：天然产物PL通过靶向抑制DDX3X的RNA依赖性ATP酶活性，动态诱导DDX3X阳性SG组装，进而抑制NLRP3炎症小体介导的小胶质细胞焦亡和线粒体功能障碍，在CPZ和EAE两种MS动物模型中发挥抗神经炎症、抗氧化和髓鞘保护作用，为MS及相关神经退行性疾病的治疗提供了基于DDX3X-SG轴的新型治疗策略。
