综述：肥大细胞蛋白酶及其在生理学、病理学与治疗策略中的意义

《Pharmacological Reviews》：Mast Cell Proteases and Their Significance in Physiology, Pathology, and Therapeutic Approaches

　　

肥大细胞（mast cells，MCs）是多功能且具有高度可塑性的免疫细胞，在生理稳态维持和致病过程中发挥广泛作用。MCs 分布于大多数组织，包括皮肤、肺、肠道和腹膜，并且其数量、类型及生物学功能存在差异。MCs 参与针对多种病原体的宿主防御，包括细菌、病毒和真菌。此外，MCs 在抵御毒素方面也至关重要，包括来自多种物种毒液中的毒素，如蜜蜂、蛇、蝎子和蜥蜴。尽管 MCs 在宿主防御中具有重要作用，但其更广为人知的是在过敏反应中的有害作用，例如哮喘、食物过敏、过敏性休克、肥大细胞增多症以及多种炎症性皮肤疾病。在这些情况下，MCs 被激活（通过 IgE 介导或其他机制）并释放一系列强效促炎介质，包括肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）。除细胞因子外，MCs 还是组胺以及多种蛋白酶的重要来源，包括胰凝乳蛋白酶（chymase）、类胰蛋白酶（tryptase）和羧肽酶A3（carboxypeptidase A3，CPA3）。因此，这些介质共同促成炎症状态及其他疾病相关的病理表现。该综述主要聚焦于 MCs 及其蛋白酶的生物学作用，重点讨论胰凝乳蛋白酶和类胰蛋白酶，并评述其抑制剂作为 MC 驱动性疾病候选治疗策略的潜力。

I. 肥大细胞导论

本综述首先概述肥大细胞（mast cells，MCs）的基本生物学特征。MCs 属于髓系谱系，在血液中以未成熟细胞形式循环，并在组织内完成终末分化。与嗜碱性粒细胞相比，MCs 为组织驻留细胞且寿命较长。除作为先天免疫效应细胞外，越来越多证据表明其还参与适应性免疫应答调控。MCs 含有大量分泌颗粒，兼具溶酶体样特征，颗粒内部呈酸性并富含多种预形成介质，因此常被视为“分泌性溶酶体”。颗粒内储存生物胺、细胞因子及多种活性蛋白酶，包括胰凝乳蛋白酶、β-类胰蛋白酶和羧肽酶A3（carboxypeptidase A3，CPA3），其释放与新生合成的脂质介质、细胞因子、趋化因子及生长因子共同塑造炎症、组织修复和发育过程。文章强调，MCs 不仅是屏障组织中的哨兵细胞，也是组织稳态、重塑和生长的重要调控者。

II. 肥大细胞的历史与进化起源

A. 肥大细胞的发现

本部分回顾了 MCs 的发现与认识演进。1863 年，颗粒性细胞首先在蛙肠系膜中被观察到；1878 年，Paul Ehrlich 将其命名为“Mastzellen”。早期研究曾错误推测其颗粒富含营养物质，后续研究则逐步揭示其富集组胺、肝素及多种炎症介质。20 世纪 90 年代的实验明确 MCs 来源于骨髓中的造血干/祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cells），不同于多数在骨髓内成熟的髓系细胞，MCs 需迁移至组织后成熟。随后，研究者进一步认识到 MCs 在过敏反应、宿主防御、组织损伤防护及慢性炎症维持中的双重作用。文中还介绍了较新的发现，包括 MCs 可通过细胞外颗粒结构捕获中性粒细胞并维持其活性，以及 MC 细胞外颗粒可形成由肝素与多胺通过静电作用组装的无膜生物活性凝聚体，这些发现扩展了对 MC 生物学功能的理解。

B. 肥大细胞的进化起源

作者指出，具有 MC 样特征的细胞在进化上可追溯至 5 亿多年前。海洋无脊椎动物和被囊动物中已存在含肝素、组胺及丝氨酸蛋白酶复合物的颗粒细胞，其形态学与脱颗粒反应均与哺乳动物 MCs 相似。该保守性提示，MCs 在免疫防御和其他细胞发育调节中具有重要进化价值。

III. 肥大细胞谱系及其蛋白酶

A. 肥大细胞祖细胞

本节系统梳理了 MCs 的发育来源。小鼠 MCs 源于胚胎期和成年期多个发育“波次”，包括卵黄囊（yolk sac，YS）红系-髓系祖细胞（erythroid–myeloid progenitors，EMPs）以及主动脉-性腺-中肾区（aorta–gonad–mesonephros，AGM）产生的造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）。骨髓形成后，表达 integrin α4β7、CX3CR1 和 KIT 的 MC 祖细胞离开骨髓，经血流进入组织，在干细胞因子（stem cell factor，SCF）和白细胞介素-3（interleukin-3，IL-3）等局部信号作用下成熟。人类 MC 祖细胞通常表现为 CD34⁺/KIT⁺，并在极早胚胎期即可出现谱系承诺。成熟 MCs 通常不再存在于外周血中，其表型和功能受所处组织微环境深刻塑造。文中还强调，稳态下的组织驻留 MCs 多具有胚胎来源，而炎症中募集的 MCs 通常来源于骨髓。

B. 肥大细胞蛋白酶的发现

本节回顾了 MC 蛋白酶研究的关键里程碑。自 1959 年起，研究者先后从大鼠腹腔灌洗液、人肺和皮肤组织中分离鉴定出具有不同酶学活性的蛋白酶，分别发展为今日所称的胰凝乳蛋白酶、β-类胰蛋白酶以及羧肽酶A3。CPA3 被证实可切割血管紧张素 I（angiotensin I，Ang I）羧基末端。上述发现奠定了 MC 蛋白酶生化多样性与组织特异功能研究的基础。

IV. 人与小鼠肥大细胞的异质性及分类

该部分重点论述 MCs 的异质性。人类 MCs 经典上按颗粒蛋白酶组成分为 MCT 和 MCTC 两大类，前者以类胰蛋白酶阳性为主，后者同时表达类胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，且常伴 CPA3 表达。小鼠则传统上按组织定位分为黏膜型 MCs（mucosal mast cells，MMCs）和结缔组织型 MCs（connective tissue mast cells，CTMCs）。不同物种在胰凝乳蛋白酶基因座扩增程度、蛋白酶构成及组织分布方面均有显著差异。转录组学尤其是单细胞 RNA 测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）进一步揭示，人类 MCs 至少可分为 6 个转录群，其在器官间呈异质分布，提示 MCs 应被理解为连续变化且受局部环境调节的细胞状态谱系，而非固定的二元分类。

V. 肥大细胞受体

本节总结了 MCs 感知环境与启动反应的受体网络。高亲和力 IgE 受体 FcεRI 是 MC 脱颗粒的核心受体，其激活可诱导组胺、细胞因子和蛋白酶释放。SCF 受体 KIT（CD117）则对 MC 发育、存活和增殖至关重要，并可与 FcεRI 信号协同放大脱颗粒反应。Mas 相关 G 蛋白偶联受体 X2（Mas-related G protein-coupled receptor X2，MRGPRX2）介导多种 IgE 非依赖性激活，参与瘙痒、疼痛、神经源性炎症及药物诱导反应。MCs 还表达 Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）、补体受体、组胺受体、细胞因子受体、黏附分子和趋化因子受体等，从而参与病原体识别、补体介导炎症、细胞迁移以及与 T 细胞、B 细胞、神经元和基质细胞的双向交流。作者还概述了性激素受体与免疫检查点分子在 MC 功能调节中的作用，提示 MCs 参与性别差异性疾病及肿瘤免疫逃逸。

VI. 肥大细胞颗粒

作者指出，MC 颗粒在形态与内容物上均具有显著异质性。颗粒内除多种水解酶外，还富含丝甘聚糖蛋白聚糖（serglycin proteoglycan）。其糖胺聚糖链可为肝素型或硫酸软骨素型，分别常见于 CTMCs 与 MMCs。丝甘聚糖带有高密度负电荷，可通过静电作用储存组胺、5-羟色胺、多巴胺以及多种带正电的蛋白酶，并影响这些酶的稳定性、活化及底物切割特性。因此，颗粒不仅是储库，也是调控 MC 蛋白酶生物活性的关键微环境。

VII. 胰凝乳蛋白酶

A. 胰凝乳蛋白酶的结构与活性

本节阐述胰凝乳蛋白酶（chymase）的系统发生、基因组成与底物特异性。胰凝乳蛋白酶家族分为 α 和 β 两个亚家族。人类仅有一种 α-胰凝乳蛋白酶，由 CMA1 编码；其多数底物切割位点位于芳香族氨基酸之后。小鼠和大鼠则具有多种胰凝乳蛋白酶，且不同同工酶在底物偏好和功能上存在明显差异。文中特别指出，Mcpt5 虽在序列上接近人胰凝乳蛋白酶，但表现出更偏向弹性蛋白酶样的切割特异性；相较之下，Mcpt4 在功能上更接近人胰凝乳蛋白酶。

B. 胰凝乳蛋白酶的生物学作用

作者总结了胰凝乳蛋白酶在宿主防御、血管紧张素生成、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）重塑、细胞因子调控及屏障功能中的多层次作用。其可降解毒液肽类并增强机体对蜂、蛇及蜥蜴毒素的耐受；在人心脏中则参与 Ang II 形成，并与高血压、血管病变及心肌重塑相关。胰凝乳蛋白酶还能激活基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），影响胶原沉积、纤维化进展及组织重构；同时还可切割 TNF-α、IL-33、Hsp70、TGF-β1 相关复合体及某些趋化因子，提示其既可能放大炎症，也可能促进炎症消退。此外，文中总结了其在肠屏障通透性调节中的作用，并指出部分作用具有显著组织依赖性和疾病情境依赖性。因此，胰凝乳蛋白酶既不能简单视为致病因子，也不能单纯归类为保护因子，其生物学效应取决于局部微环境和炎症背景。

C. 胰凝乳蛋白酶抑制剂

本节评述多种选择性胰凝乳蛋白酶抑制剂的研究进展。TY-51469、NK3201、fulacimstat（BAY-1142524）等化合物已在自身免疫性心肌炎、糖尿病、肺纤维化、溃疡性结肠炎、非酒精性脂肪性肝炎、血栓形成等模型中显示潜力。作者同时指出，抑制剂存在明显物种差异性与选择性问题，脱靶风险及跨物种活性差异仍是转化应用的重要限制。

VIII. 类胰蛋白酶

A. 类胰蛋白酶的结构与活性

类胰蛋白酶（tryptase）是人 MCs 中最丰富的颗粒蛋白。人类相关基因位于 16p13.3，包括 TPSG1、TPSB2、TPSAB1 和 TPSD1。研究主要集中于 α 和 β 亚型。β-类胰蛋白酶的成熟活化依赖两个步骤：首先由组织蛋白酶 C 去除前肽，其后在 pH 5–6 环境及肝素型丝甘聚糖辅助下形成具有活性的四聚体。其晶体结构显示，四个活性位点面向中央孔道，孔径限制了仅有小肽或柔性环结构可进入，从而使多数大分子内源性蛋白酶抑制剂无法接近活性中心。肝素不仅稳定四聚体，也通过变构方式影响酶活性。相比之下，α-类胰蛋白酶由于 S1 特异性口袋塌陷而酶活性缺失，但其可与 β 亚基形成 α/β 异源四聚体，并呈现不同底物偏好。文中还讨论了遗传性 α-类胰蛋白酶增多症（hereditary α-tryptasemia，HαT）的分子基础与临床表现。

B. 类胰蛋白酶的生物学作用

作者总结类胰蛋白酶在气道重塑、纤维化、凝血调控、趋化和神经炎症中的作用。其可刺激气道上皮细胞与支气管平滑肌细胞，增强气道高反应性、成纤维细胞增殖与胶原生成；还可通过蛋白酶激活受体 2（protease-activated receptor 2，PAR2）促进肺成纤维细胞迁移。类胰蛋白酶能切割纤维蛋白原并干预凝血，也可作用于纤维连接蛋白（fibronectin）等 ECM 成分。除蛋白水解功能外，其还具有显著趋化效应，可招募嗜酸性粒细胞和中性粒细胞，并增强中性粒细胞胞外诱捕网形成。研究还提示，类胰蛋白酶可影响血脑屏障和微血管通透性，并参与抗菌防御。血清类胰蛋白酶升高也是 MC 活化综合征等疾病的重要诊断标志。

IX. 羧肽酶A3

A. CPA3 的结构与活性

CPA3 属于 M14A 金属羧肽酶家族，是一种含锌外肽酶。与丝氨酸蛋白酶家族中的胰凝乳蛋白酶和类胰蛋白酶不同，CPA3 在酸性颗粒环境中活性较低，在中性至弱碱性条件下活性更高。CPA3 含有较多带正电残基，因此能与颗粒中带负电的丝甘聚糖强烈结合。文中提到，若干 A/B 型羧肽酶抑制剂在实验性哮喘模型中呈现保护效应，但这些抑制剂并不特异针对 CPA3，因此其具体归因仍需谨慎解释。

B. CPA3 的生物学作用

CPA3 主要被描述为具有保护性解毒功能的蛋白酶，能够处理内皮素和毒液来源肽类。基因敲除研究显示，CPA3 与某些小鼠类胰蛋白酶共同参与减轻内皮素-1 诱导的反应。与此同时，CPA3 与多种疾病相关，包括过敏反应、系统性肥大细胞增多症、慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、COVID-19、肿瘤及胃肠道炎症等。其在哮喘和过敏性疾病中常表现为表达升高，并被视为潜在生物标志物。然而，关于 CPA3 的底物谱、切割位点及其功能后果，目前认识仍较有限。

X. 肥大细胞动物模型

本节综述了 MC 研究中常用的小鼠模型。经典的 Kit 或 SCF 缺陷模型，如 Kit^W/W-v 和 Kit^W-sh/W-sh 小鼠，虽表现为严重 MC 缺失，但常伴随贫血、生殖细胞异常、肠道 Cajal 间质细胞缺陷或髓系异常增生等非 MC 特异性表型。通过骨髓来源未成熟 MCs 或造血干细胞回输可实现一定程度“敲回”，但重建后的 MC 分布与数量常不完全生理化。为克服这些局限，研究者开发了不依赖 Kit 的新模型，如 Cpa3^Cre/+ 、Mcpt5-Cre 和 Chm:Cre 模型，用于更特异地耗竭或追踪特定 MC 亚群。这些模型显著推动了 MC 功能研究，但不同模型适用于不同组织和亚型，解释实验结果时仍需谨慎。

XI. 以肥大细胞为靶点的治疗策略

作者在本部分系统讨论了 MC 靶向治疗思路，包括减少 MC 数量、诱导凋亡、颗粒通透化以及抑制激活与信号通路。针对 SCF:KIT 轴的酪氨酸激酶抑制剂，如伊马替尼（imatinib），在哮喘和侵袭性系统性肥大细胞增多症中显示出降低 MC 数量和血清类胰蛋白酶水平的效果，但由于缺乏细胞特异性，存在脱靶风险。通过 TRAIL-R 激动剂、BH3 模拟物等诱导 MC 凋亡虽具理论吸引力，但抗凋亡分子广泛表达，也限制了选择性。鉴于 MC 颗粒与溶酶体相似，溶酶体/颗粒通透化药物如 LLOMe、siramesine 和甲氟喹（mefloquine）可选择性诱导 MC 死亡，显示出一定转化前景。在抑制激活方面，抗 IgE 单抗奥马珠单抗（omalizumab）已用于哮喘等过敏性疾病；Siglec-8、SYK、PI3K、BTK、Orai 通道等也是潜在干预靶点。肥大细胞稳定剂如色甘酸钠虽安全，但效力有限。作者指出，现有治疗在 IgE 非依赖性疾病中的效果常不理想，提示仍需更深入理解 MC 生物学并发展更精准的蛋白酶和受体靶向策略。

XII. 肥大细胞研究中的技术挑战

本节讨论 MC 研究的关键方法学瓶颈。由于 MCs 在组织内成熟且受局部细胞因子环境重塑，单纯依赖体外培养或动物模型难以充分反映其真实生物学行为。小鼠与人类 MCs 在发育需求、FcεRI 调控、介质反应及药物敏感性等方面存在显著差异。人体组织驻留 MCs 数量稀少且分离困难，而现有细胞系如 HMC-1、LAD2、LUVA 等又难以完全模拟原代组织 MCs。组织染色方法如甲苯胺蓝、ChAE 和部分免疫组化也存在灵敏度或特异性限制。近年来，scRNA-seq、CRISPR-Cas9 干预结合单细胞成像、hiPSCs 来源 MCs 培养等新技术为该领域提供了新路径，但组织解离、样本应激、稀有细胞捕获效率及培养周期长等问题仍待解决。

XIII. 应用 N 端组学研究肥大细胞蛋白酶

作者强调，MC 蛋白酶通过对底物进行不可逆蛋白水解，形成重要的翻译后调控层。阐明其底物谱及精确切割位点，对于理解其生物学后果至关重要。文中列举了胰凝乳蛋白酶和类胰蛋白酶对 pro-IL-18、pro-IL-1β、膜结合型 SCF、pro-NGF、PAR2 及 PRG4 等底物的切割实例。为系统解析这些事件，作者提出 N 端组学（N-terminomics）尤其是 TAILS（Terminal Amine Isotopic Labeling of Substrates）工作流，可在体内尺度无偏倚鉴定底物并精确定位切割位点，从而构建 MC 蛋白酶-底物网络并推断其功能结果。

XIV. 未来展望

A. 提高肥大细胞分类分辨率

作者认为，未来研究应超越 MMCs/CTMCs 的传统二分法，结合单细胞组学与空间组学，在不同组织和疾病阶段界定 MC 状态，并通过纵向分析揭示细胞因子、生长因子及 ECM 线索如何持续重塑 MC 表型。

B. 重新定义蛋白酶为信号枢纽

胰凝乳蛋白酶、类胰蛋白酶和 CPA3 不应仅被视为效应分子，而应被看作重塑细胞因子网络、神经-免疫互作及 ECM 架构的信号整合酶。未来需依靠蛋白质组学、降解组学与空间组学建立体内定量底物网络。

C. 屏障界面与神经免疫界面的肥大细胞

鉴于 MCs 位于皮肤、肺和肠道等屏障部位，未来研究将更关注其在微生物、毒液和环境毒素感知中的哨兵作用，以及其与上皮细胞、神经元和基质细胞之间的反馈环路，特别是在疼痛、瘙痒和神经源性炎症中的意义。

D. 肥大细胞蛋白酶的精准靶向

治疗开发可能从广泛抑制 MCs 转向同工酶选择性和情境选择性的蛋白酶调控。结构指导设计、蛋白酶激活前药，以及与抗 IgE、生物制剂或警报素通路抑制剂联合治疗，可能更适用于哮喘、食物过敏、过敏性休克风险降低及肥大细胞增多症等场景。

XV. 结论

文章最后指出，改进鼠-人转化模型、建立人源化 MC 系统以及整合转录组学、蛋白质组学、分泌组学与蛋白酶活性谱，将有助于定义以 MC 为中心的疾病内表型，并推动个体化治疗发展。总体而言，MCs 具有显著组织异质性和复杂功能，其蛋白酶既是疾病效应分子，也是潜在生物标志物和治疗靶点。随着多组学技术进步，MC 研究将进一步揭示其在稳态、宿主防御、炎症和组织重塑中的核心作用。