Nogo-B通过激活NRF2-SLC7A11轴增强抗氧化防御从而减轻血管钙化

《Redox Biology》：Nogo-B attenuates vascular calcification by activating NRF2-SLC7A11 to enhance antioxidant defense

　　

目的

血管钙化（vascular calcification，VC）以血管内钙盐异常沉积为特征，可显著增加不良心血管事件风险。然而，VC背后的机制尚未被完全阐明。Nogo-B作为网状蛋白家族（reticulon family）成员之一，已被证实参与内膜新生血管形成、肥胖及代谢相关脂肪性肝病等多种病理过程，但其在VC中的作用尚未被研究。

研究方法与结果

研究人员采用尼古丁和维生素D₃（vitamin D₃，VD₃）在C57BL/6J小鼠及平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）特异性Nogo敲除小鼠（Nogo^SMKO）中诱导VC。在离体（ex vivo）层面，建立了高磷条件下的人动脉成骨样模型；在体外（in vitro）层面，建立了高磷诱导的人主动脉平滑肌细胞（human aortic smooth muscle cells，HASMCs）成骨样模型。结果显示，Nogo-B在钙化的人和小鼠主动脉，以及高磷处理的HASMCs中均显著下调。此外，SMC特异性敲除Nogo-B可加重VC；相反，过表达Nogo-B则抑制HASMCs的成骨分化。机制上，Nogo-B通过上调氨基酸转运体溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）的表达而抑制VC。Nogo-B与SLC7A11存在强相互作用，并促进去泛素化酶OTU结构域含泛素醛结合蛋白1（OTU domain-containing ubiquitin aldehyde-binding protein 1，OTUB1）的募集，从而阻止SLC7A11在K30位点发生K63连接型泛素化。此外，Nogo-B介导的SLC7A11上调增强了细胞内谷胱甘肽（glutathione，GSH）合成，进而激活核因子红系2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，NRF2）。NRF2作为SLC7A11的转录增强因子发挥作用。最终，Nogo-B激活抗氧化防御并缓解氧化应激，从而抑制血管钙化。

结论

该研究鉴定出Nogo-B是VC的新型调控因子。Nogo-B通过调节OTUB1介导的去泛素化稳定SLC7A11蛋白，并增强GSH/NRF2信号轴，由此促进谷胱甘肽合成、降低氧化应激，并抑制血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的成骨分化及VC进展。

该研究发表于《Redox Biology》，聚焦血管钙化（vascular calcification，VC）中平滑肌细胞成骨分化的分子调控问题。VC广泛见于动脉粥样硬化、高血压、慢性肾病和主动脉瓣狭窄等疾病，是心血管不良结局的重要危险因素。现有研究认为，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）由收缩表型向成骨样表型转变，是VC发生发展的核心病理环节；与此同时，炎症相关氧化应激被视为驱动这一过程的重要上游因素。然而，连接细胞应激、抗氧化防御与VSMCs成骨转分化的关键调控节点仍不清晰。Nogo-B作为RTN4/Nogo家族成员，既往已被证实参与血管重塑、代谢异常和内皮功能失衡，但其在血管钙化中的作用一直缺乏直接证据，因此开展本研究具有明确的病理机制与潜在干预靶点意义。

研究人员首先从临床样本、公共数据库及多层次模型中系统观察Nogo-B与VC的关系，随后结合遗传学敲除、体外过表达和机制干预实验，解析Nogo-B是否参与并如何调控血管钙化。整体结果表明：Nogo-B在钙化血管组织和高磷诱导的HASMCs中持续下调；平滑肌细胞特异性缺失Nogo-B会显著加重小鼠血管中膜钙化，而过表达Nogo-B则抑制HASMCs及离体人动脉组织的钙化。进一步机制研究显示，Nogo-B通过转录后和转录双重层面上调SLC7A11，增强GSH合成、激活NRF2依赖的抗氧化防御，从而减轻氧化应激并抑制VSMCs成骨分化。该研究由此将Nogo-B定位为VC中的保护性调控因子，并提出Nogo-B-SLC7A11-NRF2轴是具有潜在转化价值的新型抗钙化通路。

主要技术方法概括：研究整合单细胞RNA测序数据再分析、临床人颈动脉斑块与肾动脉样本检测、人体主动脉和外周动脉离体高磷钙化模型、HASMCs高磷成骨分化模型，以及VD₃/尼古丁诱导的小鼠中膜钙化模型；并采用SM22-Cre与Myh11Cre-ERT2条件性敲除、RNA-seq、免疫荧光、免疫组化、Western blot、qPCR、Co-IP、ChIP、ROS与GSH测定等方法。人样本来源于中国科学技术大学附属第一医院及安徽医科大学第二附属医院。

研究结果

一、Nogo-B与血管钙化呈负相关
研究人员重分析GSE159677单细胞RNA测序数据，发现RTN4/Nogo在多种细胞中以VSMCs表达最为显著，且在动脉粥样硬化钙化核心区较邻近区域明显降低，并与钙化评分负相关。GEO数据集GSE58150进一步显示，冠状动脉钙化患者外周血清RTN4蛋白水平下降。临床样本方面，无论是伴内膜钙化的颈动脉斑块，还是慢性肾病患者伴中膜钙化的肾动脉，Nogo-B均在RUNX2高表达的钙化区域降低。离体高磷培养的人主动脉和外周动脉，以及VD₃/尼古丁诱导的小鼠主动脉中膜钙化模型中，Nogo-B表达均明显下降。高磷处理HASMCs后，Nogo-B随时间降低且与BMP2变化趋势相反。上述结果共同证明Nogo-B下降是VC的稳定特征之一。

二、Nogo-B抑制血管钙化
在功能层面，研究人员在人主动脉离体培养中上调Nogo-B后观察到钙化沉积减少、RUNX2表达下降；相反，敲低Nogo-B会加重离体血管钙化。HASMCs实验中，Nogo-B过表达降低茜素红染色阳性面积和钙含量，抑制RUNX2、BMP2表达，并上调SMA、SM22α等收缩表型标志物；Nogo-B敲低则产生相反效应。体内实验进一步构建两种平滑肌细胞特异性Nogo敲除小鼠模型：诱导型NogoiSMKO和组成型Nogo^SMKO。在VD₃/尼古丁诱导条件下，两种模型均出现更严重的全主动脉及主动脉根部钙化，并伴随RUNX2、BMP2升高。结果明确表明，Nogo-B是抑制VSMCs成骨转分化和VC进展的重要内源性因子。

三、Nogo-B通过上调SLC7A11抑制HASMCs成骨分化
RNA-seq提示，Nogo-B过表达后差异基因富集于铁死亡（ferroptosis）、氧化磷酸化及活性氧代谢调控等通路，其中关键枢纽分子SLC7A11显著上调。研究人员进一步通过Western blot和qPCR证实，Nogo-B上调SLC7A11，而Nogo-B敲低则降低SLC7A11。SLC7A11在钙化人动脉、钙化小鼠主动脉及高磷诱导HASMCs中同样呈下降趋势。功能验证显示，过表达SLC7A11可抑制HASMCs及离体人动脉钙化，敲低SLC7A11或采用抑制剂HG106则促进钙化。更关键的是，敲低SLC7A11能够消除Nogo-B过表达的抗钙化效应，而过表达SLC7A11能够挽救Nogo-B缺失所致的促钙化表型，说明SLC7A11是Nogo-B抑制VC的关键下游执行分子。

四、Nogo-B通过去泛素化酶OTUB1稳定SLC7A11
为阐明Nogo-B如何调控SLC7A11，研究人员进行了共免疫沉淀（Co-IP）和共定位分析，证实Nogo-B与SLC7A11发生直接相互作用。进一步使用蛋白酶体、溶酶体和自噬抑制剂比较发现，MG132可以逆转Nogo-B缺失引起的SLC7A11下降，提示Nogo-B主要通过泛素-蛋白酶体途径调控SLC7A11稳定性。泛素化分析显示，Nogo-B过表达抑制SLC7A11泛素化，而Nogo-B敲低则增强其泛素化；该效应主要涉及K63连接型泛素链。研究又通过数据库筛选和实验验证确定OTUB1参与这一过程：Nogo-B、OTUB1与SLC7A11形成复合物，且Nogo-B增强OTUB1与SLC7A11结合。点突变实验证明，SLC7A11的K30是该轴调控的关键位点。功能上，OTUB1敲低降低SLC7A11并促进HASMCs成骨分化，同时削弱Nogo-B的保护作用。该部分结果说明，Nogo-B通过促进OTUB1介导的去泛素化，抑制SLC7A11在K30位点发生K63连接型泛素化，从而稳定其蛋白丰度。

五、Nogo-B通过抑制氧化应激抑制HASMCs成骨分化
鉴于SLC7A11的核心功能是转运胱氨酸以支持GSH合成，研究人员进一步评估氧化还原状态变化。结果显示，Nogo平滑肌特异性敲除小鼠主动脉ROS水平升高；在人动脉离体模型及HASMCs中，过表达Nogo-B或SLC7A11均降低总ROS和线粒体ROS，而敲低二者则升高ROS。与之对应，Nogo-B或SLC7A11过表达可增加细胞内GSH，敲低则降低GSH。与此同时，Nogo-B还能上调GCL、GSS、GST、GR和GPX4等GSH合成与利用相关基因。蛋白水平上，VC过程中NRF2、HO-1和CAT下降，KEAP1升高；Nogo-B或SLC7A11过表达则逆转这一变化。功能干预方面，使用GSH合成抑制剂丁硫氨酸亚砜亚胺（buthionine sulfoximine，BSO）可抵消Nogo-B或SLC7A11的抗钙化作用，而补充N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）则可缓解Nogo-B或SLC7A11缺失导致的促钙化效应。这表明Nogo-B通过SLC7A11-GSH途径增强抗氧化防御，进而抑制VSMCs成骨化。

六、Nogo-B通过NRF2诱导的SLC7A11转录抑制HASMCs成骨分化
研究人员进一步发现，Nogo-B不仅在转录后层面稳定SLC7A11，也在转录层面促进其表达。基于UCSC和JASPAR数据库分析，在SLC7A11启动子区发现NRF2结合的抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）。ChIP实验表明，Nogo-B过表达显著增强NRF2在SLC7A11启动子区域的富集；同时，在Nogo缺失小鼠主动脉中NRF2核转位减少，而在Nogo-B过表达的人动脉离体组织中NRF2核转位增加。NRF2敲低后，SLC7A11 mRNA下降，ROS升高，GSH减少，并显著促进HASMCs钙化。NAC可逆转NRF2敲低带来的促钙化作用。更进一步，NRF2敲低可明显削弱Nogo-B过表达的抗钙化效应，而SLC7A11过表达则能挽救NRF2缺失诱导的钙化增强。结合BSO可阻断NRF2核转位和其对SLC7A11启动子的结合，研究最终提出Nogo-B通过提升SLC7A11和GSH水平激活NRF2，NRF2再反向增强SLC7A11转录，形成正反馈抗氧化环路。

讨论总结
论文讨论部分指出，Nogo-B在不同类型血管钙化模型中均表现为保护性分子，其作用核心是维持VSMCs的抗氧化稳态，而非单纯影响某一成骨标志物。该研究将Nogo-B与SLC7A11/OTUB1/NRF2信号网络相连接，说明内质网蛋白可通过蛋白稳态和转录调控双重机制共同限制氧化应激，最终抑制VSMCs成骨转分化。文章也强调，骨组织成骨与血管钙化虽然共享部分分子，但调控结果并不完全一致，例如OTUB1在骨稳态与血管中的作用方向存在差异，提示血管钙化具有特异性调控背景。作者同时指出若干局限：SLC7A11作为Nogo-B下游靶点的体内验证仍需加强；目前仅采用VD₃/尼古丁单一中膜钙化模型，尚需在更多模型中验证普适性；不同Nogo亚型的具体贡献仍待区分。

研究结论翻译
总之，该研究鉴定内质网蛋白Nogo-B为VSMCs成骨分化和血管钙化的新型抑制因子。Nogo-B通过转录激活与转录后去泛素化两条途径稳定SLC7A11蛋白丰度，保证GSH持续合成并及时清除过量ROS。由充足GSH维持的低氧化应激微环境进一步使NRF2保持激活状态，持续驱动SLC7A11表达，从而使细胞维持稳健的抗氧化防御稳态。这些发现提示，Nogo-B可能成为血管钙化治疗的潜在靶点。