披针问荆介导合成四氧化三钴纳米颗粒及其多方面生物医学应用

《Journal of Nanotechnology》：Equisetum diffusum–Mediated Synthesis of Cobalt Oxide Nanoparticles for Multifaceted Biomedical Applications

　　

本研究首次报道了利用披针问荆（Equisetum diffusum）水提物作为天然还原剂和稳定剂，通过绿色合成法制备四氧化三钴纳米颗粒（Co₃O₄NPs）。对所合成的ED@Co₃O₄NPs进行了全面表征：紫外-可见光谱（UV-Vis）显示在323 nm处有吸收峰；傅里叶变换红外光谱（FTIR）证实了ED提取物和ED@Co₃O₄NPs中官能团的存在。X射线衍射（XRD）证实了尖晶石相Co₃O₄的形成，平均晶粒尺寸为15.17 nm，而扫描电子显微镜（SEM）分析显示纳米颗粒呈均匀分布的球形，平均直径为58.56 nm。动态光散射（DLS）和Zeta电位（-32 mV）表明其具有良好的胶体稳定性。研究人员评估了ED@Co₃O₄NPs的生物学潜力，证明其对铜绿假单胞菌（25 mm）、大肠埃希菌（22 mm）和表皮葡萄球菌（12 mm）具有显著抗菌活性。抗氧化实验显示其活性呈浓度依赖性增加，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）清除率从38.75%增至80.41%，铁还原抗氧化能力（FRAP）还原力从26.05 mg AAE/g增至70.44 mg AAE/g。溶血活性在0.5 μg/μL时为0.10%，在5 μg/μL时为3.76%，表明低浓度下毒性较低。初步抗凝和溶栓实验提示其具有有前景的止血调节潜力。这些发现突出了ED@Co₃O₄NPs在多种生物医学应用中的潜力。

纳米技术已成为全球科学研究中最具活力且发展最为迅速的领域之一。金属及金属氧化物纳米颗粒（NPs）因其尺寸小、比表面积高的独特优势，在电化学催化、传感、制药、生物医学、化妆品及食品技术等领域得到广泛应用。在众多金属氧化物纳米颗粒中，四氧化三钴纳米颗粒（Co₃O₄NPs）因其在生物医学等领域的多功能应用而备受关注。然而，传统的物理化学合成方法往往存在能耗高、耗时长、成本高昂且环境危害大等问题。为克服这些挑战，绿色合成策略应运而生，即利用植物提取物等可再生、可持续的生物资源作为天然还原剂和稳定剂进行生物合成，该方法具有能耗低、化学添加剂少、成本低且无毒环保等显著优势。同时，植物提取物中的生物活性植物化学成分（如生物碱和黄酮类化合物）能够改善纳米颗粒的特性并发挥还原与稳定作用。

当前，抗生素抗性微生物的激增对全球健康构成严重威胁，现有抗生素治疗因溶解性差、不稳定及副作用等因素日益失效，亟需新型抗菌剂和高效药物递送系统。纳米技术凭借纳米颗粒独特的理化性质、增强的生物分布、改善的细胞摄取及靶向递送潜力，为应对这一挑战提供了有希望的平台。Co₃O₄NPs因其能够产生大量高还原性活性氧（ROS）以及较小的晶粒尺寸，表现出强效的抗菌活性，其作用机制涉及破坏细胞膜完整性、形成孔洞和凹陷、干扰DNA复制以及降低呼吸链酶活性等多个方面。此外，纳米颗粒无论其来源如何均可能进入血液循环，因此评估其血液相容性至关重要，其中溶血活性是评价纳米颗粒血液相容性的重要指标。Co₃O₄NPs还显示出作为潜在抗凝和溶栓剂的显著功效。尽管披针问荆（Equisetum diffusum）具有已知的药理潜力，但其在Co₃O₄NPs绿色合成中的应用尚未被探索，且植物介导的Co₃O₄NPs在抗菌、抗氧化、抗凝和溶栓活性方面的系统评价仍然有限。基于此，本研究旨在利用披针问荆水提物进行Co₃O₄NPs的生态友好型合成，并对其多功能生物医学活性进行评价。该工作符合联合国可持续发展目标（UNSDG）第3项和第12项，支持可持续纳米材料的发展，促进环境可持续性并推动安全生物医学纳米材料的进步。本研究发表于《Journal of Nanotechnology》。

研究人员为开展此项研究采用了以下主要关键技术方法：样本来源为采自巴基斯坦开伯尔-普赫图赫瓦省北瓦济里斯坦县米尔阿里乡的披针问荆植物样本，经萨戈达大学植物学助理教授Ms. Naima Huma Naveed鉴定，标本编号为SARGU/CHEM-027，存放于萨戈达大学植物标本馆。表征技术包括：紫外-可见分光光度计（UV-1700 Pharmspec, Shimadzu）用于光学特性分析；傅里叶变换红外光谱（FTIR）用于官能团检测；扫描电子显微镜（SEM）用于表面形貌、尺寸和形态分析；动态光散射（DLS）和Zeta电位分析仪（Malvern Zetasizer Nano ZS）用于粒径分布和胶体稳定性评价；X射线衍射仪（XRD, JDX-3532, JEOL）用于晶体结构和纯度确认；能量色散X射线光谱（EDX）用于元素组成分析；热重分析/差示扫描量热法（TGA/DSC, SDT 650）用于热稳定性评估。生物学评价方法包括：采用琼脂扩散法（well diffusion method）测定抗菌活性，微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）；DPPH自由基清除实验和FRAP实验评价抗氧化活性；体外溶血实验评价血液相容性；以及抗凝和溶栓活性实验。

**绿色合成与表征结果**

**ED@Co₃O₄NPs的绿色合成**：研究人员以披针问荆水提物作为天然还原剂、封端剂和稳定剂，与1 M六水合硝酸钴溶液混合，在约80°C下持续搅拌2小时，溶液颜色由黄色变为红棕色，确认Co₃O₄NPs的形成。产物经洗涤后于70°C干燥12小时，再在400°C马弗炉中煅烧2小时以提高结晶度，最终获得深棕色ED@Co₃O₄NPs。

**紫外-可见光谱分析**：UV-Vis光谱显示ED@Co₃O₄NPs在323 nm处有特征吸收峰，归属为纳米颗粒的表面等离子体共振（SPR）带，宽化的最大吸收峰表明颗粒尺寸分布较大。该吸收归因于尖晶石晶格中氧与钴离子之间的电荷转移。

**XRD分析**：XRD图谱在2θ = 31.90°（220）、35.38°（311）、38.03°（222）、46.26°（400）、56.44°（511）和76.36°（622）处的衍射峰与标准JCPDS卡片No. 42-1467一致，证实了尖晶石相Co₃O₄的形成。平均晶粒尺寸约为15.17 nm，位错密度约为4.35 × 10¹⁵ m^-2，晶面间距为2.48 ?（对应高强度峰（511）），平均晶格参数约为0.8167 nm。

**FTIR分析**：FTIR光谱对比显示，植物提取物在约3454 cm^-1处的O-H伸缩振动峰、2900 cm^-1处的C-H伸缩振动峰以及1726 cm^-1处的C=O伸缩振动峰等，而合成后的ED@Co₃O₄NPs在572和607 cm^-1处出现Co-O伸缩振动峰，证实了钴氧化物的存在，同时保留了植物提取物的部分峰，表明生物分子作为封端剂稳定了纳米颗粒。

**SEM分析**：SEM显示绿色合成的ED@Co₃O₄NPs为均匀分布、近乎球形的颗粒，无明显团聚现象，表明其具有优异的稳定性和均一形貌。粒径分布直方图显示平均粒径为58.56 nm，标准偏差为0.45 nm。

**EDX分析**：EDX分析确认了C（17.78%）、O（49.17%）、Na（1.00%）和Co（32.05%）的元素组成，强氧和钴信号验证了Co₃O₄NPs的成功形成，碳和钠信号则归因于披针问荆提取物的植物化学成分。

**DLS与Zeta电位分析**：DLS显示平均粒径为63.37 nm，略大于SEM结果，这归因于DLS测量的是水化动力学直径。Zeta电位为-32 mV，表明纳米颗粒悬浮液具有良好的稳定性和静电排斥作用。

**TGA/DSC分析**：TGA显示，15.60至200°C范围内有1.27 mg（7.092%）的轻微失重，归因于水和挥发性有机物的蒸发；343.09°C附近有显著失重（15.031 mg，16.69%），对应植物源有机组分的分解；815.9°C以下进一步失重至13.014 mg（27.58%），表明有机物残余的消除和Co₃O₄的完全结晶化，900°C时最终残余量为12.841 mg（28.48%）。DSC分析显示玻璃化转变温度位于259.97°C，氧化起始温度为220.78°C，447.34°C处的放热过程（焓变2670.5 J/g）归因于ED@Co₃O₄NPs的结晶化和稳定化。

**抗菌活性**：ED@Co₃O₄NPs对三种菌株均表现出显著抗菌活性，抑菌圈直径分别为：铜绿假单胞菌25 mm、大肠埃希菌22 mm、表皮葡萄球菌12 mm。与阳性对照头孢曲松（ceftriaxone）相比，ED@Co₃O₄NPs的抗菌效果具有统计学可比性（Tukey HSD检验）。MIC结果分别为：铜绿假单胞菌20 μg/mL、大肠埃希菌20 μg/mL、表皮葡萄球菌30 μg/mL；MBC结果分别为20 μg/mL、40 μg/mL和50 μg/mL。铜绿假单胞菌对ED@Co₃O₄NPs最为敏感，而革兰阳性菌表皮葡萄球菌则需要最高浓度才能达到杀菌效果。

**抗氧化活性**：DPPH自由基清除实验显示，ED@Co₃O₄NPs的清除率随浓度增加而升高，在100-300 μL范围内从38.75%增至80.41%，在300 μL时清除率达78.75%，与抗坏血酸标准品相当甚至更高。FRAP实验显示，ED@Co₃O₄NPs的还原力从100 μL时的26.05 mg AAE/g增至300 μL时的70.44 mg AAE/g，在300 μL时与抗坏血酸的73.9 mg AAE/g接近。

**体外溶血活性**：ED@Co₃O₄NPs在0.5-5 μg/mL浓度范围内的溶血率从0.10%增至3.76%，呈浓度依赖性增加。由于5%溶血率通常被认为是生物材料的可接受限值，ED@Co₃O₄NPs在所有测试浓度下均满足该标准，表明其在低浓度下具有相对安全性，但高浓度时溶血活性增加提示需谨慎考虑临床剂量。

**抗凝和溶栓分析**：抗凝实验中，对照组（无ED@Co₃O₄NPs）在15分钟内开始凝血，60分钟形成大血块；20 μg/mL组在60分钟内凝血；30 μg/mL组60分钟后无显著变化，显示抗凝活性开始显现；40 μg/mL组即使在60分钟后也无凝血迹象，表现出最佳抗凝活性。溶栓实验中，10-40 μg/mL的ED@Co₃O₄NPs处理30分钟后，10 μg/mL组血块部分液化，20 μg/mL组进一步溶解，30 μg/mL组显著液化，40 μg/mL组血块完全溶解，表明该浓度在30分钟内可实现完全溶栓。

**与以往文献的比较**：与化学共沉淀法、其他植物介导合成法及非绿色电化学合成法相比，本研究采用的披针问荆介导的绿色合成法在抗菌性能上具有竞争优势，且避免了化学还原剂和表面活性剂的使用，具有更广谱的生物活性和更优的环保特性。与以往研究多集中于单一抗菌评价不同，本研究提供了包括抗氧化、溶血、抗凝和溶栓在内的综合生物学评价。

**讨论部分总结**：研究人员指出，绿色合成的ED@Co₃O₄NPs具有均匀球形形貌、良好的胶体稳定性和高结晶度，这些特性有利于生物医学应用中的生物相互作用。植物提取物的生物活性成分不仅作为还原剂和稳定剂参与纳米颗粒合成，还可能通过表面修饰增强其生物性能。抗菌活性机制涉及纳米颗粒与微生物细胞壁的附着、膜破坏、ROS产生及代谢干扰等多重作用。抗氧化活性的浓度依赖性表明其具有潜在的自由基清除应用价值。低浓度下的良好血液相容性以及显著的抗凝和溶栓活性，提示ED@Co₃O₄NPs在止血调节方面具有应用潜力。然而，研究人员也指出，当前抗凝和溶栓研究主要基于定性观察，未来需结合定量分析方法（如血浆复钙时间、凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间等）进行更全面的机制评价。该工作为绿色合成纳米材料在生物医学领域的应用提供了重要参考，符合可持续发展目标。

**研究结论**：本研究成功利用披针问荆水提物合成了Co₃O₄NPs，建立了一条生态友好、经济高效的绿色合成路线。ED@Co₃O₄NPs的表征确认了其纳米级尺寸：UV-Vis光谱显示323 nm处的吸收峰；FTIR揭示了负责纳米颗粒稳定的官能团；SEM显示均匀球形形貌，平均直径58.56 nm；XRD证实晶体结构，平均晶粒尺寸约15.17 nm；EDX显示了纳米颗粒的元素组成；DLS和Zeta电位分析进一步证实了合成纳米颗粒的稳定性和尺寸分布。绿色合成的ED@Co₃O₄NPs表现出显著的抗菌活性，特别是对铜绿假单胞菌（25 mm抑菌圈）和大肠埃希菌（22 mm抑菌圈）。通过DPPH和FRAP实验评估的抗氧化活性显示，清除活性随浓度增加而增强，DPPH清除率从100 μL时的38.75%增至300 μL时的80.41%，FRAP还原力从100 μL时的26.05增至300 μL时的70.44 mg AAE/g。溶血研究证实了低浓度下的生物相容性（溶血率0.10%-3.76%）。纳米颗粒还表现出优异的抗凝和溶栓特性，高浓度时显著抑制血液凝固并完全溶解血块。绿色合成的ED@Co₃O₄NPs在多种生物医学应用中显示出有希望的潜力，包括抗菌、抗氧化、抗凝和溶栓活性。