AI引导的实验室进化逆转录酶重设计增强引导编辑效率

《Nature Biotechnology》：AI-guided redesign of laboratory-evolved reverse transcriptases enhances prime editing

　　

尽管蛋白工程与实验室进化已被用于优化引导编辑器，但研究人员发现此前可提升引导编辑效率的突变同时会损害蛋白稳定性与表达水平，从而限制其性能。为解决这些局限，研究人员应用结构知情的人工智能引导方法（如逆折叠网络ProteinMPNN）对经工程改造与进化的引导编辑器中的逆转录酶（RT）结构域进行重设计，同时保留催化必需区域。重设计的RT包含30至163个氨基酸替换，表现出增强的折叠稳定性与可溶性表达，且在mRNA递送后细胞内引导编辑器蛋白水平最高提升2倍。重设计的PE8引导编辑器在多种离体场景中均显示出更高的编辑效率，包括多种人类原代细胞类型及多种递送模式。在小鼠模型中，其编辑效率较当前最先进的PE6、PE7及PEmax引导编辑器最高提升2.9倍。这些发现提出了一种可推广的策略，可通过增强实验室进化来改进基因组编辑工具。

该研究针对引导编辑（prime editing, PE）中因实验室进化导致逆转录酶（reverse transcriptase, RT）稳定性下降、表达受限从而影响编辑效率的核心问题，由研究人员在《Nature Biotechnology》发表成果，通过结构导向的AI蛋白设计策略实现了RT的系统性优化，开发出新一代PE8编辑器，在离体与体内模型中均显著提升编辑性能。

关键技术方法包括：以噬菌体辅助连续进化（phage-assisted continuous evolution, PACE）获得的PE6及PEmax编辑器RT结构域为起点，采用ProteinMPNN逆折叠网络在保留催化核心与进化保守残基的前提下进行大规模序列重设计；结合AlphaFold2进行结构置信度筛选；通过脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle, LNP）介导的mRNA递送体系在Hepa1-6细胞及原代细胞中评估编辑效率；构建含700个ClinVar致病突变的自靶向慢病毒文库进行高通量筛选；利用差示扫描荧光法（differential scanning fluorimetry, DSF）与体外逆转录活性实验表征蛋白稳定性与功能；在小鼠模型中通过眶后注射进行体内编辑验证。

研究结果如下：

实验室进化的RT稳定性下降

研究人员首先证实，相比野生型RT，经PACE进化或工程改造的PE6a、PE6c、PE6d及PEmax编辑器在LNP-mRNA递送后，Hepa1-6细胞内的峰值蛋白水平降低1.5至2.0倍，表明表达量与稳定性已成为当前引导编辑器的瓶颈。

RT序列重设计与计算结构预测

研究团队建立了计算流程，以距离底物超过15–20 ?且进化保守性低于25%–50%的残基作为可设计区域，为每个起始RT生成96个候选序列。经AlphaFold2评估，重设计RT与原始结构高度相似（均方根偏差root mean squared deviation, r.m.s.d.中位数0.94–1.94 ?），且结构置信度（predicted local distance difference test, pLDDT）普遍高于85，成功探索了包含最多202个氨基酸替换的新序列空间。

重设计RT提升培养细胞中的引导编辑效率

在LNP-mRNA递送体系中，174个候选RT中有165个支持高于5%的编辑效率，其中30%优于原始进化版本。最优变体在Pcsk9 +1 TTAC插入位点分别实现PEmax 2.3倍、PE6a 1.7倍、PE6c 1.3倍与PE6d 1.4倍的提升。保守性约束（≥25%）是保证功能的关键因素。

重设计RT提升致病突变矫正效率

针对700个ClinVar致病突变的高通量筛选显示，PE6a与PE6c的重设计变体平均编辑效率分别提升2.1倍与1.4倍，而M-MLV来源的PEmax与PE6d因原有热稳定性突变基础，提升幅度较小（1.1–1.4倍）。最优变体被命名为PE8a、PE8c、PE8d与PE8max，其在多个疾病相关位点的矫正效率均显著优于PE7（PEmax–La融合体），平均提升1.3至4.2倍。

重设计提升RT的表达水平与热稳定性

蛋白水平检测显示，PE8变体在哺乳动物细胞中的峰值表达量较对应原始版本提升1.2至2.3倍。细菌纯化与无细胞表达实验证实可溶性产量显著增加，差示扫描荧光法测定PE8c与PE8max的熔解温度（melting temperature, T_m）分别提升8 °C与2 °C，PE8d在高温下的逆转录活性也优于PE6d。

PE8变体在治疗应用中的效能提升

在多种递送模式下，PE8均表现优异：原代人成纤维细胞中Bloom综合征位点编辑提升1.3倍；CD34⁺造血干细胞中对镰状细胞病相关HBB位点以更低mRNA剂量达到50%编辑效率；活化T细胞中IL2RB正交化编辑在低剂量下提升1.6倍；工程化病毒样颗粒（engineered virus-like particle, eVLP）递送时，Neuro-2A细胞中Dnmt1位点编辑提升1.6倍；小鼠体内LNP递送后，肝脏Pcsk9位点编辑效率较PE6c、PE6d与PEmax分别提升1.4倍、2.9倍与2.5倍，且未增加脱靶或indel形成。

讨论与结论

研究人员指出，蛋白工程与实验室进化常以提升催化活性为目标，却牺牲了稳定性与表达，限制了治疗应用。本研究通过ProteinMPNN对RT结构域进行AI引导的重设计，在保留进化获得的高效催化特性的同时，显著提升了折叠稳定性与细胞内表达。PE8编辑器在超过700个致病突变及多种治疗相关递送场景中均展现卓越性能。研究人员建议，在空间受限场景优先选用紧凑的PE8a，追求最高体内活性时推荐PE8c，eVLP递送首选PE8c，常规研究可将其作为标准工具。该工作证明AI蛋白设计可有效弥补定向进化的稳定性缺陷，为复杂多亚基基因组编辑工具的优化提供了通用框架，将加速引导编辑在临床治疗中的应用。