基于振动光谱表征的单菌种与多菌种菌群生物膜发育、胁迫响应及异质性研究

《npj Biofilms and Microbiomes》：Probing biofilm development, stress response and heterogeneity—spectroscopic characterization of single and multi-species consortia

　　

环境细菌生物膜在生态系统中承担营养物质循环与作为摄食生物食物来源的功能，其生物学和化学组成受包括环境胁迫因子在内的多种参数调控。研究人员构建并表征了一个由瑞典一条小型河流中分离得到的四种细菌组成的模型体系：假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)及副根瘤菌属(Pararhizobium sp.)。在无药物及存在甲氧苄啶(trimethoprim)条件下，研究人员结合振动光谱、低温X射线光电子能谱(cryo-XPS)与共聚焦光学显微镜，对单菌种及共培养体系的细胞形态、生物膜结构及生化组成进行了系统表征。化学分析结果显示，不同菌株及药物暴露条件下，能量储存物质聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates, PHA)与多糖含量存在显著差异。拉曼显微光谱成像揭示，在四菌种混合体系中，鞘氨醇单胞菌以微小聚集体形式分布于生物膜内部，这种空间组织方式在甲氧苄啶暴露过程中对该菌株起到了保护作用。

该研究发表于《npj Biofilms and Microbiomes》，针对淡水环境中抗生素污染日益普遍、生物膜微生物响应机制尚不明确的科学问题展开。自然水体生物膜结构高度动态且受多重环境因素耦合影响，导致原位研究难以解析具体作用机制。研究人员采用简化模型策略，从瑞典克尼夫斯塔河(Knivsta?n)下游分离获得四种可共存的细菌，旨在构建兼具环境代表性与实验可控性的多菌种生物膜模型，并以常用抗菌剂甲氧苄啶为胁迫因子，探究其对生物膜化学组成、空间结构及种间互作的影响。

关键技术方法包括：从同一采样点分离并筛选四种淡水细菌，完成全基因组测序与表型鉴定；利用衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)、拉曼显微光谱(Raman microspectroscopy)及低温X射线光电子能谱(cryo-XPS)对菌体及生物膜的化学组成进行非标记原位表征；采用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)分析生物膜三维结构与活/死细胞分布；通过多元曲线分辨交替最小二乘法(MCR-ALS)与贝叶斯正定源分离(BPSS)解析拉曼高光谱图像的空间化学异质性。

研究结果如下：

生长、形态与运动性：四种菌株均呈杆状，假单胞菌运动性最强且具有极性鞭毛，鞘氨醇单胞菌在富胞外聚合物(EPS)条件下表现出滑行运动特征，副根瘤菌与根瘤菌分别形成胶囊样结构与松散EPS层。

化学组成表征：ATR-FTIR与cryo-XPS显示各菌株表面生化组成差异显著，鞘氨醇单胞菌在低营养条件下胞外富含聚羟基脂肪酸酯(PHA)与糖原，拉曼光谱中特征性类胡萝卜素信号为其提供了种特异性标记。

单菌种生物膜形成：原位FTIR监测表明，假单胞菌生物膜生长呈振荡模式，根瘤菌与副根瘤菌在静态培养后期大量积累PHA，鞘氨醇单胞菌则形成厚度可达150 μm的疏松生物膜。

浮游细胞胁迫响应：除假单胞菌外，其余三种菌株对甲氧苄啶呈浓度依赖性敏感，敏感菌株在暴露24 h后显著提升PHA合成水平，提示其为一种应激保护机制。

生物膜形态与结构：CLSM显示单菌种生物膜在厚度、覆盖度及活/死细胞比例上差异明显，甲氧苄啶暴露导致敏感菌株膜损伤加剧并改变生物膜体积，酸性条件进一步抑制EPS生成。

共培养体系：四菌种生物膜呈分层结构，上层基质类似副根瘤菌生物膜，下层为假单胞菌主导区域；甲氧苄啶与酸性双重胁迫下，鞘氨醇单胞菌以小型活细胞簇形式嵌于耐受性更强的假单胞菌主导的生物膜中。拉曼成像证实此类空间异质性在多菌种体系中稳定存在，并缓解了对敏感菌的杀伤效应。

讨论部分指出，该模型体系通过整合微生物学表型与化学组学表征，实现了对淡水生物膜胁迫响应的机制解析。研究发现多菌种空间异质性与种间互作可显著提升群落对环境胁迫的抗性，其中PHA积累与EPS重塑是关键生理适应策略。该成果为理解自然水体中抗生素污染对微生物群落结构与功能的影响提供了实验依据，所建立的多菌种模型亦可作为研究环境生物膜生理生态过程的通用平台。研究结论强调，敏感菌在多菌种生物膜中的空间庇护效应是环境微生物维持群落稳定性的重要机制，对评估抗生素生态风险及开发生物膜调控技术具有重要参考价值。